目的在體外構(gòu)建攜帶CCL5和SSTR2雙基因的重組溶瘤痘病毒,并初步檢測其溶瘤活性。方法利用基因工程策略,分步構(gòu)建重組痘病毒真核表達(dá)質(zhì)粒pSC65-CCL5-SSTR2-Luc+;經(jīng)同源重組痘病毒W(wǎng)estern Reverse (WR)株和23輪篩選純化后,獲得純化的重組溶瘤痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+;經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)及濃縮純化后獲得高滴度的重組溶瘤痘病毒,用ELISA和Western blot分別驗證感染重組溶瘤痘病毒的HeLa細(xì)胞CCL5和SSTR2的表達(dá)變化;用CCK-8法檢測了rVV-CCL5-SSTR2-Luc+對兩株腫瘤細(xì)胞系的殺傷活力。結(jié)果成功構(gòu)建了重組痘病毒真核表達(dá)質(zhì)粒pSC65-CCL5-SSTR2-Luc+;經(jīng)同源重組、篩選純化和濃縮后,獲得滴度為9.4×10⁸ PFU/mL的重組溶瘤痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+;ELISA和Western blot結(jié)果表明,HeLa細(xì)胞感染rVV-CCL5-SSTR2-Luc+后,其CCL5和SSTR2蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組rVV-Luc+(分別為P<0.05和P<...

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 試劑及試劑盒:
        1.1.2 細(xì)胞、質(zhì)粒和病毒株:
    1.2 方法
        1.2.1 痘病毒真核表達(dá)載體pSC65-CCL5-SSTR2-Luc+的構(gòu)建:
        1.2.2 同源重組構(gòu)建pSC65-CCL5-SSTR2-Luc+/pSC65-Luc+重組痘病毒:
        1.2.3 痘病毒陽性重組子的篩選純化:
        1.2.4 重組痘病毒的擴(kuò)大培養(yǎng)及濃縮純化:
        1.2.5 結(jié)晶紫染色法測定重組痘病毒滴度:
        1.2.6 ELISA和Western blot分別驗證重組痘病毒的CCL5和SSTR2蛋白表達(dá):
        1.2.7 CCK-8測定重組痘病毒腫瘤細(xì)胞殺傷活力:
2 結(jié)果
    2.1 重組質(zhì)粒pSC65-CCL5-SSTR2-Luc的構(gòu)建與鑒定
    2.2 重組痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+/ rVV-Luc+的篩選純化和病毒滴度測定
    2.3 重組痘病毒陽性重組子rVV-CCL5-SSTR2-Luc+的蛋白表達(dá)驗證
    2.4 CCK-8檢測rVV-CCL5-SSTR2-Luc+對腫瘤細(xì)胞系的殺傷活力
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