p53是一種腫瘤抑制因子,可以調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄活性,從而激活或抑制其轉(zhuǎn)錄。正是由于p53的這一功能,它需要與許多蛋白產(chǎn)生相互作用。涉及包括與細(xì)胞生長,存活,程序性細(xì)胞死亡等相關(guān)生命活動的基因的調(diào)控。SRC-1是一種核受體輔激活因子,參與染色質(zhì)重塑,解凝,并對核受體轉(zhuǎn)錄調(diào)控起重要作用。由于SRC-1與核受體之間的相互作用使它在調(diào)控新陳代謝方面具有重要作用,例如控制脂肪生成,調(diào)控飽和脂肪酸儲存,調(diào)節(jié)葡萄糖代謝等。為研究p53與SRC-1之間的相互作用,探索p53對SRC-1在體內(nèi)表達(dá)是否具有某種調(diào)控作用并找出調(diào)控的方式。本研究通過分子克隆手段構(gòu)建p53和SRC-1不同片段的表達(dá)載體,并通過Alpha Screen生化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)p53(5-293)和SRC-1(105-385)在體外存在相互作用,然后通過Pull Down實(shí)驗(yàn),親和層析實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。體內(nèi)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)p53蛋白對SRC-1蛋白表達(dá)有抑制作用,通過蛋白合成抑制劑,蛋白酶體抑制劑和自噬抑制劑處理細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)p53是通過某種泛素化酶對SRC-1進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,使SRC-1蛋白被顯著降解。接著通過免疫共沉淀和蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證了它們...

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1. 前言
    1.1 p53的簡介
        1.1.1 p53蛋白的功能結(jié)構(gòu)域
        1.1.2 p53蛋白的信號通路
        1.1.3 p53蛋白的生物學(xué)功能
    1.2 SRC-1簡介
        1.2.1 核受體簡介
        1.2.2 核受體輔調(diào)節(jié)因子
        1.2.3 P160類固醇受體輔因子(SRC)基因家族
        1.2.4 SRC-1結(jié)構(gòu)與功能
    1.3 泛素化途徑
        1.3.1 泛素化
        1.3.2 p53與泛素化途徑
        1.3.3 SRCs與泛素化途徑
    1.4 研究的進(jìn)展與意義
2. 材料與方法
    2.1 常用試劑與儀器
    2.2 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2.1 細(xì)胞株
        2.2.2 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)
    2.3 分子克隆相關(guān)方法
        2.3.1 載體與質(zhì)粒
        2.3.2 質(zhì)粒構(gòu)建
    2.4 融合蛋白的表達(dá)與純化
        2.4.1 融合蛋白的表達(dá)
        2.4.2 融合蛋白的純化
        2.4.3 聚丙烯凝膠電泳
    2.5 AlphaScreen分析實(shí)驗(yàn)
    2.6 Pull-Down實(shí)驗(yàn)
    2.7 免疫共沉淀Co-IP和蛋白印跡WB
        2.7.1 免疫共沉淀Co-IP
        2.7.2 Western Blot
3. 結(jié)果與分析
    3.1 腫瘤抑制因子p53及核受體輔激活因子SRC-1的片段截取
    3.2 p53和SRC-1融合蛋白的表達(dá)與純化
        3.2.1 p53融合蛋白的表達(dá)與純化
        3.2.2 SRC-1融合蛋白的表達(dá)與純化
    3.3 p53和SRC-1體外相互作用的研究
        3.3.1 Alphascreen分析實(shí)驗(yàn)檢測蛋白相互作用
        3.3.2 Pull Down實(shí)驗(yàn)檢測蛋白相互作用
        3.3.3 共表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SRC-1與p53的相互作用
        3.3.4 體外驗(yàn)證相互作用結(jié)果
    3.4 過表達(dá)p53可抑制SRC-1 PAS表達(dá)
    3.5 p53通過泛素化途徑對SRC-1 PAS進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控
        3.5.1 在阻斷蛋白合成途徑后,p53加速SRC-1 PAS降解
        3.5.2 泛素化途徑的阻斷回調(diào)p53對SRC-1 PAS的抑制作用
    3.6 Co-IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證p53與SRC-1 PAS相互作用
4. 討論
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號：3804560