目的:低氧能促進(jìn)腫瘤的侵襲和遷移。HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄輔抑制因子CtBP1抑制了上皮細(xì)胞黏附分子E-cadherin的表達(dá),促進(jìn)了細(xì)胞的侵襲和遷移;CtBP1是否介導(dǎo)了低氧誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞遷移尚不明確。本研究通過體外細(xì)胞培養(yǎng),觀察低氧對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞遷移能力的影響,及HepG2細(xì)胞中CtBP1蛋白及其靶基因上皮細(xì)胞黏附分子E-cadherin蛋白表達(dá)的改變;并采用siRNA干擾技術(shù),敲低CtBP1的表達(dá),探討CtBP1是否介導(dǎo)了低氧對(duì)肝癌細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用,為闡明肝細(xì)胞肝癌惡性進(jìn)展的分子機(jī)制及靶向治療提供新的理論依據(jù)。方法:Western blot法檢測(cè)肝癌細(xì)胞株HUH7、BEL-7402、BEL-7404、SMMC-7721及HepG2細(xì)胞中CtBP1蛋白的表達(dá)情況。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果,我們采用CtBP1表達(dá)最高的HepG2細(xì)胞,轉(zhuǎn)染CtBP1 siRNA,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)共分為兩部分:第一部分觀察低氧條件下HepG2細(xì)胞遷移能力及細(xì)胞形態(tài)的改變。采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同缺氧時(shí)間(24小時(shí),48小時(shí))對(duì)HepG2細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力的影響、采用免疫熒光法檢測(cè)低氧對(duì)HepG2細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)...

【文章頁(yè)數(shù)】：77 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
英漢縮略詞對(duì)照表
前言
1 材料與方法
    1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1.1 細(xì)胞株
        1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及耗材
            1.1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)試劑
            1.1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑
            1.1.2.3 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑
            1.1.2.4 其他普通試劑及耗材
        1.1.3 所需主要實(shí)驗(yàn)試劑的配制
        1.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器
    1.2 實(shí)驗(yàn)方法
        1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            1.2.1.1 人肝癌細(xì)胞的復(fù)蘇
            1.2.1.2 人肝癌細(xì)胞的換液
            1.2.1.3 人肝癌細(xì)胞的傳代
            1.2.1.4 人肝癌細(xì)胞的計(jì)數(shù)和接種
            1.2.1.5 人肝癌細(xì)胞的凍存
        1.2.2 建立細(xì)胞低氧模型
        1.2.3 人肝癌細(xì)胞株HepG2的CtBP1 siRNA(h)轉(zhuǎn)染
            1.2.3.1 最佳干擾濃度的篩選
            1.2.3.2 人肝癌細(xì)胞株HepG2的CtBP1 siRNA(h)轉(zhuǎn)染和低氧實(shí)驗(yàn)
        1.2.4 Western blot法測(cè)低氧條件下轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞CtBP1和E-cadherin的表達(dá)
            1.2.4.1 HepG2細(xì)胞總蛋白的提取
            1.2.4.2 BCA蛋白濃度的測(cè)定
            1.2.4.3 樣品蛋白上樣體系的配制
            1.2.4.4 SDS-PAGE凝膠的配制
            1.2.4.5 SDS-PAGE凝膠電泳
            1.2.4.6 蛋白質(zhì)的濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)模
            1.2.4.7 蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)
            1.2.4.8 蛋白質(zhì)的檢測(cè)
        1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)低氧條件下轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力
        1.2.6 細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)低氧條件下轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞的形態(tài)化
        1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
2 結(jié)果
    2.1 CtBP1在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)
    2.2 低氧條件下HepG2細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力逐漸增強(qiáng)且細(xì)胞形態(tài)從上皮樣多邊形轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)樣梭形
    2.3 低氧作用于HepG2細(xì)胞使CtBP1表達(dá)上調(diào)而其靶蛋白上皮黏附分子E-cadherin表達(dá)下調(diào)
    2.4 當(dāng)CtBP1 siRNAs（h）濃度為0.06pmol/μl時(shí)干擾效率最高
    2.5 敲低CtBP1抑制了低氧對(duì)HepG2細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力的促進(jìn)作用且抑制了低氧條件下間質(zhì)樣細(xì)胞形態(tài)的改變
    2.6 敲低CtBP1基因部分挽救了低氧對(duì)E-cadherin表達(dá)的抑制作用
3 討論
4 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄
致謝



本文編號(hào)：3774006