發(fā)布時間：2023-02-10 07:41

　　熱休克蛋白90(90 k Da heat shock protein,Hsp90)是普遍存在于原核和真核細胞中的一種必不可少且高度保守的分子伴侶,通過與細胞內多種客戶蛋白形成復合體,協助這些客戶蛋白在細胞內轉運、跨膜,參與蛋白質的折疊、伸展及多聚復合體的組裝,從而起到維持細胞內蛋白質穩(wěn)定的作用。研究證實,Hsp90在多種癌癥細胞中表達水平均明顯上升,Hsp90可以通過幫助其下游多種致癌客戶蛋白的折疊、裝配和成熟,促進癌細胞的生存和侵襲,并對癌癥細胞在面對體內外許多不利環(huán)境(如放、化療)時具有保護作用。因此,抑制Hsp90活性已經成為癌癥治療的一個有效策略。在過去的二十年里,涌現出了多種Hsp90抑制劑,如嘌呤支架類化合物格爾德霉素(geldanamycin)及其衍生物17-AAG、天然產物根赤殼菌素(radicicol)和一些小分子肽類等。這些Hsp90抑制劑多以阻斷Hsp90 N端的ATP結合位點為機制。迄今為止,已有17種藥物進入臨床試驗。然而,細胞內廣泛存在的其他ATP酶使得這些藥物無法做到高度特異,其臨床效果均不理想,至今未有一個通過美國食品與藥品管理局(Food and Dr...

【文章頁數】：111 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略詞表
第1章 緒論
    1.1 熱休克蛋白 90
        1.1.1 熱休克蛋白
        1.1.2 熱休克蛋白90及其結構
        1.1.3 熱休克蛋白90的共分子伴侶及客戶蛋白
        1.1.4 熱休克蛋白90與腫瘤的關系
    1.2 熱休克蛋白90抑制劑
        1.2.1 Hsp90的N-端抑制劑
        1.2.2 Hsp90的C-端抑制劑
        1.2.3 Hsp90的中間結構域抑制劑以及結合位點尚未明確的抑制劑
    1.3 熱休克蛋白90與共分子伴侶細胞分裂周期蛋白 37
        1.3.1 細胞分裂周期蛋白 37
        1.3.2 Hsp90/Cdc37抑制劑
    1.4 海腎熒光素酶雙分子互補技術
    1.5 研究目的和理論意義
第2章 基于Hsp90/Cdc37結構的新型Hsp90抑制劑篩選體系的建立
    2.1 背景
    2.2 實驗材料與儀器
        2.2.1 質粒和菌株
        2.2.2 試劑和耗材
        2.2.3 溶液配制
        2.2.4 引物
        2.2.5 儀器
    2.3 實驗方法
        2.3.1 重組質粒的構建
        2.3.2 IPTG誘導蛋白的表達及純化
        2.3.3 SDS-PAGE電泳和免疫印跡分析
        2.3.4 點突變
        2.3.5 互補RL活性優(yōu)化及化合物處理
    2.4 實驗結果
        2.4.1 質粒構建
        2.4.2 NRL-Hsp90α 和Cdc37-CRL融合蛋白的表達和純化
        2.4.3 互補RL活性的優(yōu)化
        2.4.4 體外SRL-PFAC分析系統(tǒng)的特異性檢測
        2.4.5 化合物處理
    2.5 討論與小結
        2.5.1 討論
        2.5.2 小結
第3章 芹菜素通過阻斷Hsp90/Cdc37抑制胰腺癌細胞生長和遷移作用研究
    3.1 背景
    3.2 實驗材料與儀器
        3.2.1 材料
        3.2.2 試劑
        3.2.3 溶液配制
        3.2.4 引物
        3.2.5 儀器
    3.3 實驗方法
        3.3.1 細胞培養(yǎng)
        3.3.2 細胞轉染及RL分析
        3.3.3 點突變
        3.3.4 免疫印跡和免疫共沉淀
        3.3.5 MTS實驗分析
        3.3.6 劃痕實驗分析
        3.3.7 胞內ROS檢測分析
    3.4 實驗結果
        3.4.1 SRL-PFAC分析結果表明芹菜素在HEK293細胞中能夠阻斷Hsp90/Cdc37相互作用
        3.4.2 芹菜素阻斷Hsp90/Cdc37相互作用的功能并不依賴于CK2激酶活性
        3.4.3 芹菜素在胰腺癌細胞中能夠阻斷Hsp90/Cdc37復合物形成并誘導下游客戶蛋白降解
        3.4.4 芹菜素能夠抑制胰腺癌細胞的生長
        3.4.5 芹菜素能夠抑制胰腺癌細胞的遷移
        3.4.6 芹菜素能夠在胰腺癌細胞中誘導ROS的積累
    3.5 討論與小結
        3.5.1 討論
        3.5.2 小結
第4章 結論
參考文獻
攻讀學位期間發(fā)表的學術論文
致謝



本文編號：3739288