發(fā)布時(shí)間：2023-02-10 07:41

　　熱休克蛋白90(90 k Da heat shock protein,Hsp90)是普遍存在于原核和真核細(xì)胞中的一種必不可少且高度保守的分子伴侶,通過與細(xì)胞內(nèi)多種客戶蛋白形成復(fù)合體,協(xié)助這些客戶蛋白在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、跨膜,參與蛋白質(zhì)的折疊、伸展及多聚復(fù)合體的組裝,從而起到維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)定的作用。研究證實(shí),Hsp90在多種癌癥細(xì)胞中表達(dá)水平均明顯上升,Hsp90可以通過幫助其下游多種致癌客戶蛋白的折疊、裝配和成熟,促進(jìn)癌細(xì)胞的生存和侵襲,并對(duì)癌癥細(xì)胞在面對(duì)體內(nèi)外許多不利環(huán)境(如放、化療)時(shí)具有保護(hù)作用。因此,抑制Hsp90活性已經(jīng)成為癌癥治療的一個(gè)有效策略。在過去的二十年里,涌現(xiàn)出了多種Hsp90抑制劑,如嘌呤支架類化合物格爾德霉素(geldanamycin)及其衍生物17-AAG、天然產(chǎn)物根赤殼菌素(radicicol)和一些小分子肽類等。這些Hsp90抑制劑多以阻斷Hsp90 N端的ATP結(jié)合位點(diǎn)為機(jī)制。迄今為止,已有17種藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)。然而,細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的其他ATP酶使得這些藥物無法做到高度特異,其臨床效果均不理想,至今未有一個(gè)通過美國(guó)食品與藥品管理局(Food and Dr...

【文章頁(yè)數(shù)】：111 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略詞表
第1章 緒論
    1.1 熱休克蛋白 90
        1.1.1 熱休克蛋白
        1.1.2 熱休克蛋白90及其結(jié)構(gòu)
        1.1.3 熱休克蛋白90的共分子伴侶及客戶蛋白
        1.1.4 熱休克蛋白90與腫瘤的關(guān)系
    1.2 熱休克蛋白90抑制劑
        1.2.1 Hsp90的N-端抑制劑
        1.2.2 Hsp90的C-端抑制劑
        1.2.3 Hsp90的中間結(jié)構(gòu)域抑制劑以及結(jié)合位點(diǎn)尚未明確的抑制劑
    1.3 熱休克蛋白90與共分子伴侶細(xì)胞分裂周期蛋白 37
        1.3.1 細(xì)胞分裂周期蛋白 37
        1.3.2 Hsp90/Cdc37抑制劑
    1.4 海腎熒光素酶雙分子互補(bǔ)技術(shù)
    1.5 研究目的和理論意義
第2章 基于Hsp90/Cdc37結(jié)構(gòu)的新型Hsp90抑制劑篩選體系的建立
    2.1 背景
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器
        2.2.1 質(zhì)粒和菌株
        2.2.2 試劑和耗材
        2.2.3 溶液配制
        2.2.4 引物
        2.2.5 儀器
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.3.2 IPTG誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)及純化
        2.3.3 SDS-PAGE電泳和免疫印跡分析
        2.3.4 點(diǎn)突變
        2.3.5 互補(bǔ)RL活性優(yōu)化及化合物處理
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.4.1 質(zhì)粒構(gòu)建
        2.4.2 NRL-Hsp90α 和Cdc37-CRL融合蛋白的表達(dá)和純化
        2.4.3 互補(bǔ)RL活性的優(yōu)化
        2.4.4 體外SRL-PFAC分析系統(tǒng)的特異性檢測(cè)
        2.4.5 化合物處理
    2.5 討論與小結(jié)
        2.5.1 討論
        2.5.2 小結(jié)
第3章 芹菜素通過阻斷Hsp90/Cdc37抑制胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移作用研究
    3.1 背景
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器
        3.2.1 材料
        3.2.2 試劑
        3.2.3 溶液配制
        3.2.4 引物
        3.2.5 儀器
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        3.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及RL分析
        3.3.3 點(diǎn)突變
        3.3.4 免疫印跡和免疫共沉淀
        3.3.5 MTS實(shí)驗(yàn)分析
        3.3.6 劃痕實(shí)驗(yàn)分析
        3.3.7 胞內(nèi)ROS檢測(cè)分析
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.4.1 SRL-PFAC分析結(jié)果表明芹菜素在HEK293細(xì)胞中能夠阻斷Hsp90/Cdc37相互作用
        3.4.2 芹菜素阻斷Hsp90/Cdc37相互作用的功能并不依賴于CK2激酶活性
        3.4.3 芹菜素在胰腺癌細(xì)胞中能夠阻斷Hsp90/Cdc37復(fù)合物形成并誘導(dǎo)下游客戶蛋白降解
        3.4.4 芹菜素能夠抑制胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)
        3.4.5 芹菜素能夠抑制胰腺癌細(xì)胞的遷移
        3.4.6 芹菜素能夠在胰腺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)ROS的積累
    3.5 討論與小結(jié)
        3.5.1 討論
        3.5.2 小結(jié)
第4章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝



本文編號(hào)：3739288