結(jié)直腸癌（Colorectal cancer,CRC）是最常見的消化道惡性腫瘤之一,雖然臨床治療技術(shù)的進(jìn)步提高了療效,但患者死亡率依然很高。深入研究CRC發(fā)生發(fā)展機(jī)制,尋求新的治療靶點(diǎn)仍然是重要任務(wù)。腫瘤干細(xì)胞（Cancer stem cell,CSC）是具有自我更新、多向分化和無限增殖等干細(xì)胞特性的細(xì)胞群體。基礎(chǔ)和臨床研究證實(shí)了CSC在CRC發(fā)生發(fā)展中的作用。髓源性抑制細(xì)胞（Myeloid derived suppressor cells,MDSC）是骨髓來源的具有免疫抑制能力的異質(zhì)性細(xì)胞群體,其在感染、炎癥及惡性腫瘤等病理狀態(tài)下大量存在。MDSC通過抑制機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答、維持腫瘤細(xì)胞干性及促進(jìn)血管形成等多種方式參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。Exosomes（Exo）是直徑為30-150 nm的囊泡,攜帶來源細(xì)胞的蛋白質(zhì)和核酸,在細(xì)胞間信息傳遞中發(fā)揮重要作用,參與腫瘤發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)。目的:本研究探討粒細(xì)胞樣MDSC（Granulocytic MDSC,G-MDSC）分泌的 exosomes（GM-Exo）與CRC細(xì)胞干性之間的關(guān)系,尋找GM-Exo調(diào)控CRC細(xì)胞干性的關(guān)鍵成分;了解缺氧對G-M... 

【文章頁數(shù)】：149 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
縮略詞
第一章 緒論
    1.1 結(jié)直腸癌
        1.1.1 散發(fā)性結(jié)直腸癌
        1.1.2 結(jié)腸炎相關(guān)癌
    1.2 腫瘤干細(xì)胞與惡性腫瘤
        1.2.1 腫瘤干細(xì)胞理論
        1.2.2 CSC的表面分子
        1.2.3 腫瘤干細(xì)胞的調(diào)控
        1.2.4 結(jié)直腸癌CSC表型及干預(yù)療效
    1.3 MDSC在結(jié)直腸癌中的作用
        1.3.1 MDSC定義
        1.3.2 腫瘤微環(huán)境對MDSC的影響
        1.3.3 MDSC來源及其免疫抑制功能
        1.3.4 MDSC在結(jié)直腸癌中的作用
    1.4 Exosomes在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用
        1.4.1 Exosomes的結(jié)構(gòu)
        1.4.2 Exosomes的合成與釋放
        1.4.3 MDSC來源exosomes的特性
        1.4.4 Exosomes在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用
    1.5 S100A9在結(jié)直腸癌中的作用
        1.5.1 S100A9的結(jié)構(gòu)
        1.5.2 S100A9活性調(diào)控
        1.5.3 S100A9的促炎作用
        1.5.4 S100A9在結(jié)直腸癌中的作用
    1.6 本研究的目的、內(nèi)容、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及意義
        1.6.1 研究目的
        1.6.2 研究內(nèi)容
        1.6.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
        1.6.4 研究意義
第二章 G-MDSC分泌exosomes增強(qiáng)CT-26細(xì)胞干性
    2.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.5 主要溶液配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 CT-26細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2.2 CT-26結(jié)直腸癌移植瘤小鼠模型構(gòu)建
        2.2.3 G-MDSC分離純化
        2.2.4 G-MDSC免疫抑制能力檢測
        2.2.5 GM-Exo制備
        2.2.6 GM-Exo蛋白定量
        2.2.7 透射電子顯微鏡觀察GM-Exo形態(tài)
        2.2.8 Westernblot檢測GM-Exo相關(guān)分子
        2.2.9 GM-Exo免疫抑制能力檢測
        2.2.10 GM-Exo在MDSC促結(jié)直腸癌腫瘤干性效應(yīng)中的作用
        2.2.11 GM-Exo在G-MDSC促腫瘤效應(yīng)中作用觀察
        2.2.12 GM-Exo促進(jìn)CT-26細(xì)胞成瘤
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 CT-26細(xì)胞形態(tài)
        2.3.2 構(gòu)建CT-26結(jié)直腸癌移植瘤模型
        2.3.3 磁珠分選出高純度的荷瘤小鼠脾臟G-MDSC
        2.3.4 G-MDSC抑制CD4+T細(xì)胞增殖反應(yīng)
        2.3.5 制備GM-Exo并定量
        2.3.6 GM-Exo的形態(tài)觀察
        2.3.7 GM-Exo表面CD63和CD9分子檢測
        2.3.8 GM-Exo具有免疫抑制能力
        2.3.9 Rab27asiRNA抑制G-MDSC中Rab27a表達(dá)
        2.3.10 Rab27a抑制減少GM-Exo釋放
        2.3.11 Rab27a抑制的G-MDSC促CT-26細(xì)胞成球能力下降
        2.3.12 Rab27a抑制的G-MDSC促CD44/133表達(dá)能力下降
        2.3.13 Rab27a抑制的G-MDSC促CT-26細(xì)胞移植瘤發(fā)生發(fā)展的能力下降
        2.3.14 GM-Exo被CT-26細(xì)胞攝取
        2.3.15 GM-Exo增強(qiáng)CT-26細(xì)胞成瘤能力
    2.4 討論
第三章 GM-Exo通過S100A9增強(qiáng)CT-26細(xì)胞干性
    3.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.1.2 耗材
        3.1.3 試劑
        3.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        3.1.5 主要溶液配制
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 Westernblot檢測GM-Exo中S100A9表達(dá)量
        3.2.2 轉(zhuǎn)染S100A9siRNA抑制GM-Exo中S100A9表達(dá)
        3.2.3 G-MDSCexosomalS100A9對結(jié)直腸癌細(xì)胞CT-26干性特性的影響
        3.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測各處理組CT-26細(xì)胞中ROS的表達(dá)
        3.2.5 Westernblot檢測Nox4/p-P65/p-Stat3水平
        3.2.6 平板克隆試驗(yàn)觀察G-MDSCexosomalS100A9對CT-26細(xì)胞增殖的影響
        3.2.7 通過移植瘤模型觀察GM-Exo攜帶的S100A9對CT-26移植瘤的影響
        3.2.8 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)觀察G-MDSCexosomalS100A9對CT-26細(xì)胞遷移的作用
        3.2.9 G-MDSCexosomalS100A9對CT-26細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移的影響
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 GM-Exo富含S100A9蛋白
        3.3.2 S100A9siRNA抑制G-MDSC和GM-Exo中S100A9蛋白表達(dá)
        3.3.3 GM-Exo呈S100A9依賴性增強(qiáng)CT-26細(xì)胞成球能力
        3.3.4 GM-Exo呈S100A9依賴性促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞表達(dá)CD44/CD
        3.3.5 GM-Exo呈S100A9依賴性促進(jìn)CT-26細(xì)胞Sox2、Oct4、Nanog及ALDH1A表達(dá)
        3.3.6 GM-Exo呈S100A9依賴性增加CT-26細(xì)胞中ROS水平
        3.3.7 GM-Exo呈S100A9依賴性方式促進(jìn)CT-26細(xì)胞Nox4/p-P65/p-Stat3水平
        3.3.8 GM-Exo呈S100A9依賴性促進(jìn)CT-26細(xì)胞增殖
        3.3.9 GM-Exo呈S100A9依賴性促進(jìn)腫瘤發(fā)展
        3.3.10 GM-Exo呈S100A9依賴性促進(jìn)腫瘤遷移
        3.3.11 GM-Exo呈S100A9依賴性促進(jìn)CT-26細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移
    3.4 討論
第四章 G-MDSCexosomalS100A9對CAC的作用
    4.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.1.2 耗材
        4.1.3 試劑
        4.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        4.1.5 主要溶液配制
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 小鼠CAC模型構(gòu)建
        4.2.2 免疫熒光檢測GM-Exo在結(jié)腸分布
        4.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測GM-Exo在結(jié)腸分布
        4.2.4 炎癥性結(jié)直腸癌處理方法
        4.2.5 觀察指標(biāo)和標(biāo)本收集、處理
        4.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組織中MDSC-和T細(xì)胞亞群
        4.2.7 免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測結(jié)腸局部S100A
        4.2.8 H(5)E染色觀察結(jié)直腸癌組織病理學(xué)變化
        4.2.9 免疫熒光檢測GM-Exo在結(jié)腸組織分布
        4.2.10 流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析CD133陽性細(xì)胞的比例
        4.2.11 G-MDSC趨化實(shí)驗(yàn)
        4.2.12 小鼠CT-26移植瘤模型構(gòu)建及干預(yù)
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 構(gòu)建CAC小鼠模型
        4.3.2 外源性GM-Exo易分布至腫瘤局部并且具有累加效果
        4.3.3 外源性GM-Exo與腫瘤局部細(xì)胞融合
        4.3.4 GM-Exo呈S100A9依賴性減輕小鼠體重
        4.3.5 GM-Exo呈S100A9依賴性減少CAC小鼠結(jié)腸長度
        4.3.6 GM-Exo呈S100A9依賴性促進(jìn)結(jié)直腸結(jié)節(jié)形成
        4.3.7 GM-Exo呈S100A9依賴性方式促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)程
        4.3.8 GM-Exo呈S100A9依賴性促進(jìn)結(jié)直腸腺瘤形成
        4.3.9 結(jié)腸組織CD133表達(dá)量與GM-Exo分布量呈正相關(guān)
        4.3.10 GM-Exo呈S100A9依賴性方式增加結(jié)直腸組織CD133陽性細(xì)胞百分比
        4.3.11 腫瘤局部S100A9含量增加
        4.3.12 腫瘤局部G-MDSC浸潤增多
        4.3.13 GM-Exo通過S100A9增加腫瘤局部G-MDSC浸潤
        4.3.14 GM-Exo依賴于S100A9趨化G-MDSC至外周血和結(jié)直腸組織
        4.3.15 G-MDS通過S100A9趨化G-MDSC
        4.3.16 G-MDSCexosomalS100A9抑制CAC小鼠外周血T細(xì)胞數(shù)量
    4.4 討論
第五章 缺氧促進(jìn)G-MDSC分泌exosomes
    5.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料
        5.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        5.1.2 耗材
        5.1.3 試劑
        5.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        5.1.5 主要溶液配制
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 脾臟及腫瘤組織來源G-MDSC分泌exosomes能力檢測
        5.2.2 qRT-PCR檢測脾臟及腫瘤來源G-MDSC中HIF-1?和HIF-2?表達(dá)量
        5.2.3 Westernblot檢測G-MDSC中HIF-1?和Rab27a蛋白水平
        5.2.4 qRT-PCR檢測缺氧和YC-1處理的G-MDSC中HIF-1?表達(dá)量
        5.2.5 ExoELISA定量G-MDSC分泌的exosoems
        5.2.6 Westernblot檢測HIF-1?抑制后Rab27a蛋白表達(dá)水平
    5.3 結(jié)果
        5.3.1 腫瘤組織來源G-MDSC較脾臟來源G-MDSC分泌exosomes能力增強(qiáng)
        5.3.2 腫瘤組織來源G-MDSC較脾臟來源G-MDSC高表達(dá)HIF-1?mRNA
        5.3.3 缺氧增加脾臟G-MDSC表達(dá)HIF-1?和Rab27a蛋白
        5.3.4 YC-1抑制G-MDSC中HIF-1?mRNA表達(dá)
        5.3.5 缺氧呈HIF-1?依賴性促進(jìn)G-MDSC分泌exosoems
        5.3.6 缺氧呈HIF-1?依賴性增強(qiáng)Rab27a蛋白表達(dá)
    5.4 討論
第六章 血漿G-MDSCexosomalS100A9在CRC復(fù)發(fā)中的臨床應(yīng)用
    6.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料
        6.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        6.1.2 耗材
        6.1.3 試劑
        6.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        6.1.5 主要溶液配制
    6.2 實(shí)驗(yàn)方法
        6.2.1 小鼠血漿exosomes制備
        6.2.2 Exosomes定量
        6.2.3 Westernblot檢測小鼠血漿exosomalS100A9水平
        6.2.4 人血漿exosomes制備
        6.2.5 流式細(xì)胞術(shù)分選人血漿CD11b+exosomes
        6.2.6 ELISA檢測CD11b+exosomes中S100A9含量
        6.2.7 ELISA檢測人血漿exosomalS100A9含量
        6.2.8 CRC患者M(jìn)DSCexosomalS100A9對SW480干性的作用
    6.3 結(jié)果
        6.3.1 小鼠血漿exosomalS100A9水平檢測
        6.3.2 FCM檢測人血漿CD11b+exosomes負(fù)載的膠體顆粒占總顆粒的百比例
        6.3.3 ELISA檢測血漿CD11b+exosomes和CD11b-exosomes中S100A9含量
        6.3.4 ELISA檢測人血漿exosomes中S100A9水平
        6.3.5 CRC患者腸癌組織M-Exo制備
        6.3.6 M-Exo呈S100A9依賴性增強(qiáng)SW480細(xì)胞成球能力
        6.3.7 CRC患者腫瘤MDSCexosomalS100A9促進(jìn)SW480移植瘤發(fā)生發(fā)展
    6.4 討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及其他科研成果
致謝



本文編號(hào)：3675055