結(jié)直腸癌（Colorectal cancer,CRC）是最常見的消化道惡性腫瘤之一,雖然臨床治療技術(shù)的進步提高了療效,但患者死亡率依然很高。深入研究CRC發(fā)生發(fā)展機制,尋求新的治療靶點仍然是重要任務(wù)。腫瘤干細胞（Cancer stem cell,CSC）是具有自我更新、多向分化和無限增殖等干細胞特性的細胞群體。基礎(chǔ)和臨床研究證實了CSC在CRC發(fā)生發(fā)展中的作用。髓源性抑制細胞（Myeloid derived suppressor cells,MDSC）是骨髓來源的具有免疫抑制能力的異質(zhì)性細胞群體,其在感染、炎癥及惡性腫瘤等病理狀態(tài)下大量存在。MDSC通過抑制機體抗腫瘤免疫應(yīng)答、維持腫瘤細胞干性及促進血管形成等多種方式參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。Exosomes（Exo）是直徑為30-150 nm的囊泡,攜帶來源細胞的蛋白質(zhì)和核酸,在細胞間信息傳遞中發(fā)揮重要作用,參與腫瘤發(fā)展的多個環(huán)節(jié)。目的:本研究探討粒細胞樣MDSC（Granulocytic MDSC,G-MDSC）分泌的 exosomes（GM-Exo）與CRC細胞干性之間的關(guān)系,尋找GM-Exo調(diào)控CRC細胞干性的關(guān)鍵成分;了解缺氧對G-M... 

【文章頁數(shù)】：149 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
縮略詞
第一章 緒論
    1.1 結(jié)直腸癌
        1.1.1 散發(fā)性結(jié)直腸癌
        1.1.2 結(jié)腸炎相關(guān)癌
    1.2 腫瘤干細胞與惡性腫瘤
        1.2.1 腫瘤干細胞理論
        1.2.2 CSC的表面分子
        1.2.3 腫瘤干細胞的調(diào)控
        1.2.4 結(jié)直腸癌CSC表型及干預(yù)療效
    1.3 MDSC在結(jié)直腸癌中的作用
        1.3.1 MDSC定義
        1.3.2 腫瘤微環(huán)境對MDSC的影響
        1.3.3 MDSC來源及其免疫抑制功能
        1.3.4 MDSC在結(jié)直腸癌中的作用
    1.4 Exosomes在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用
        1.4.1 Exosomes的結(jié)構(gòu)
        1.4.2 Exosomes的合成與釋放
        1.4.3 MDSC來源exosomes的特性
        1.4.4 Exosomes在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用
    1.5 S100A9在結(jié)直腸癌中的作用
        1.5.1 S100A9的結(jié)構(gòu)
        1.5.2 S100A9活性調(diào)控
        1.5.3 S100A9的促炎作用
        1.5.4 S100A9在結(jié)直腸癌中的作用
    1.6 本研究的目的、內(nèi)容、實驗設(shè)計及意義
        1.6.1 研究目的
        1.6.2 研究內(nèi)容
        1.6.3 實驗設(shè)計
        1.6.4 研究意義
第二章 G-MDSC分泌exosomes增強CT-26細胞干性
    2.1 實驗儀器和材料
        2.1.1 實驗儀器
        2.1.2 實驗材料
        2.1.3 實驗試劑
        2.1.4 實驗動物
        2.1.5 主要溶液配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 CT-26細胞培養(yǎng)
        2.2.2 CT-26結(jié)直腸癌移植瘤小鼠模型構(gòu)建
        2.2.3 G-MDSC分離純化
        2.2.4 G-MDSC免疫抑制能力檢測
        2.2.5 GM-Exo制備
        2.2.6 GM-Exo蛋白定量
        2.2.7 透射電子顯微鏡觀察GM-Exo形態(tài)
        2.2.8 Westernblot檢測GM-Exo相關(guān)分子
        2.2.9 GM-Exo免疫抑制能力檢測
        2.2.10 GM-Exo在MDSC促結(jié)直腸癌腫瘤干性效應(yīng)中的作用
        2.2.11 GM-Exo在G-MDSC促腫瘤效應(yīng)中作用觀察
        2.2.12 GM-Exo促進CT-26細胞成瘤
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 CT-26細胞形態(tài)
        2.3.2 構(gòu)建CT-26結(jié)直腸癌移植瘤模型
        2.3.3 磁珠分選出高純度的荷瘤小鼠脾臟G-MDSC
        2.3.4 G-MDSC抑制CD4+T細胞增殖反應(yīng)
        2.3.5 制備GM-Exo并定量
        2.3.6 GM-Exo的形態(tài)觀察
        2.3.7 GM-Exo表面CD63和CD9分子檢測
        2.3.8 GM-Exo具有免疫抑制能力
        2.3.9 Rab27asiRNA抑制G-MDSC中Rab27a表達
        2.3.10 Rab27a抑制減少GM-Exo釋放
        2.3.11 Rab27a抑制的G-MDSC促CT-26細胞成球能力下降
        2.3.12 Rab27a抑制的G-MDSC促CD44/133表達能力下降
        2.3.13 Rab27a抑制的G-MDSC促CT-26細胞移植瘤發(fā)生發(fā)展的能力下降
        2.3.14 GM-Exo被CT-26細胞攝取
        2.3.15 GM-Exo增強CT-26細胞成瘤能力
    2.4 討論
第三章 GM-Exo通過S100A9增強CT-26細胞干性
    3.1 實驗儀器和材料
        3.1.1 實驗儀器
        3.1.2 耗材
        3.1.3 試劑
        3.1.4 實驗動物
        3.1.5 主要溶液配制
    3.2 實驗方法
        3.2.1 Westernblot檢測GM-Exo中S100A9表達量
        3.2.2 轉(zhuǎn)染S100A9siRNA抑制GM-Exo中S100A9表達
        3.2.3 G-MDSCexosomalS100A9對結(jié)直腸癌細胞CT-26干性特性的影響
        3.2.4 流式細胞術(shù)檢測各處理組CT-26細胞中ROS的表達
        3.2.5 Westernblot檢測Nox4/p-P65/p-Stat3水平
        3.2.6 平板克隆試驗觀察G-MDSCexosomalS100A9對CT-26細胞增殖的影響
        3.2.7 通過移植瘤模型觀察GM-Exo攜帶的S100A9對CT-26移植瘤的影響
        3.2.8 細胞遷移實驗觀察G-MDSCexosomalS100A9對CT-26細胞遷移的作用
        3.2.9 G-MDSCexosomalS100A9對CT-26細胞肝轉(zhuǎn)移的影響
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 GM-Exo富含S100A9蛋白
        3.3.2 S100A9siRNA抑制G-MDSC和GM-Exo中S100A9蛋白表達
        3.3.3 GM-Exo呈S100A9依賴性增強CT-26細胞成球能力
        3.3.4 GM-Exo呈S100A9依賴性促進結(jié)直腸癌細胞表達CD44/CD
        3.3.5 GM-Exo呈S100A9依賴性促進CT-26細胞Sox2、Oct4、Nanog及ALDH1A表達
        3.3.6 GM-Exo呈S100A9依賴性增加CT-26細胞中ROS水平
        3.3.7 GM-Exo呈S100A9依賴性方式促進CT-26細胞Nox4/p-P65/p-Stat3水平
        3.3.8 GM-Exo呈S100A9依賴性促進CT-26細胞增殖
        3.3.9 GM-Exo呈S100A9依賴性促進腫瘤發(fā)展
        3.3.10 GM-Exo呈S100A9依賴性促進腫瘤遷移
        3.3.11 GM-Exo呈S100A9依賴性促進CT-26細胞肝轉(zhuǎn)移
    3.4 討論
第四章 G-MDSCexosomalS100A9對CAC的作用
    4.1 實驗儀器和材料
        4.1.1 實驗儀器
        4.1.2 耗材
        4.1.3 試劑
        4.1.4 實驗動物
        4.1.5 主要溶液配制
    4.2 實驗方法
        4.2.1 小鼠CAC模型構(gòu)建
        4.2.2 免疫熒光檢測GM-Exo在結(jié)腸分布
        4.2.3 流式細胞術(shù)檢測GM-Exo在結(jié)腸分布
        4.2.4 炎癥性結(jié)直腸癌處理方法
        4.2.5 觀察指標和標本收集、處理
        4.2.6 流式細胞術(shù)檢測各組織中MDSC-和T細胞亞群
        4.2.7 免疫組織化學技術(shù)檢測結(jié)腸局部S100A
        4.2.8 H(5)E染色觀察結(jié)直腸癌組織病理學變化
        4.2.9 免疫熒光檢測GM-Exo在結(jié)腸組織分布
        4.2.10 流式細胞計數(shù)分析CD133陽性細胞的比例
        4.2.11 G-MDSC趨化實驗
        4.2.12 小鼠CT-26移植瘤模型構(gòu)建及干預(yù)
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 構(gòu)建CAC小鼠模型
        4.3.2 外源性GM-Exo易分布至腫瘤局部并且具有累加效果
        4.3.3 外源性GM-Exo與腫瘤局部細胞融合
        4.3.4 GM-Exo呈S100A9依賴性減輕小鼠體重
        4.3.5 GM-Exo呈S100A9依賴性減少CAC小鼠結(jié)腸長度
        4.3.6 GM-Exo呈S100A9依賴性促進結(jié)直腸結(jié)節(jié)形成
        4.3.7 GM-Exo呈S100A9依賴性方式促進結(jié)直腸癌進程
        4.3.8 GM-Exo呈S100A9依賴性促進結(jié)直腸腺瘤形成
        4.3.9 結(jié)腸組織CD133表達量與GM-Exo分布量呈正相關(guān)
        4.3.10 GM-Exo呈S100A9依賴性方式增加結(jié)直腸組織CD133陽性細胞百分比
        4.3.11 腫瘤局部S100A9含量增加
        4.3.12 腫瘤局部G-MDSC浸潤增多
        4.3.13 GM-Exo通過S100A9增加腫瘤局部G-MDSC浸潤
        4.3.14 GM-Exo依賴于S100A9趨化G-MDSC至外周血和結(jié)直腸組織
        4.3.15 G-MDS通過S100A9趨化G-MDSC
        4.3.16 G-MDSCexosomalS100A9抑制CAC小鼠外周血T細胞數(shù)量
    4.4 討論
第五章 缺氧促進G-MDSC分泌exosomes
    5.1 實驗儀器和材料
        5.1.1 實驗儀器
        5.1.2 耗材
        5.1.3 試劑
        5.1.4 實驗動物
        5.1.5 主要溶液配制
    5.2 實驗方法
        5.2.1 脾臟及腫瘤組織來源G-MDSC分泌exosomes能力檢測
        5.2.2 qRT-PCR檢測脾臟及腫瘤來源G-MDSC中HIF-1?和HIF-2?表達量
        5.2.3 Westernblot檢測G-MDSC中HIF-1?和Rab27a蛋白水平
        5.2.4 qRT-PCR檢測缺氧和YC-1處理的G-MDSC中HIF-1?表達量
        5.2.5 ExoELISA定量G-MDSC分泌的exosoems
        5.2.6 Westernblot檢測HIF-1?抑制后Rab27a蛋白表達水平
    5.3 結(jié)果
        5.3.1 腫瘤組織來源G-MDSC較脾臟來源G-MDSC分泌exosomes能力增強
        5.3.2 腫瘤組織來源G-MDSC較脾臟來源G-MDSC高表達HIF-1?mRNA
        5.3.3 缺氧增加脾臟G-MDSC表達HIF-1?和Rab27a蛋白
        5.3.4 YC-1抑制G-MDSC中HIF-1?mRNA表達
        5.3.5 缺氧呈HIF-1?依賴性促進G-MDSC分泌exosoems
        5.3.6 缺氧呈HIF-1?依賴性增強Rab27a蛋白表達
    5.4 討論
第六章 血漿G-MDSCexosomalS100A9在CRC復(fù)發(fā)中的臨床應(yīng)用
    6.1 實驗儀器和材料
        6.1.1 實驗儀器
        6.1.2 耗材
        6.1.3 試劑
        6.1.4 實驗動物
        6.1.5 主要溶液配制
    6.2 實驗方法
        6.2.1 小鼠血漿exosomes制備
        6.2.2 Exosomes定量
        6.2.3 Westernblot檢測小鼠血漿exosomalS100A9水平
        6.2.4 人血漿exosomes制備
        6.2.5 流式細胞術(shù)分選人血漿CD11b+exosomes
        6.2.6 ELISA檢測CD11b+exosomes中S100A9含量
        6.2.7 ELISA檢測人血漿exosomalS100A9含量
        6.2.8 CRC患者MDSCexosomalS100A9對SW480干性的作用
    6.3 結(jié)果
        6.3.1 小鼠血漿exosomalS100A9水平檢測
        6.3.2 FCM檢測人血漿CD11b+exosomes負載的膠體顆粒占總顆粒的百比例
        6.3.3 ELISA檢測血漿CD11b+exosomes和CD11b-exosomes中S100A9含量
        6.3.4 ELISA檢測人血漿exosomes中S100A9水平
        6.3.5 CRC患者腸癌組織M-Exo制備
        6.3.6 M-Exo呈S100A9依賴性增強SW480細胞成球能力
        6.3.7 CRC患者腫瘤MDSCexosomalS100A9促進SW480移植瘤發(fā)生發(fā)展
    6.4 討論
結(jié)論
參考文獻
在學期間發(fā)表的學術(shù)論文及其他科研成果
致謝



本文編號：3675055