發(fā)布時(shí)間：2022-02-10 13:46

　　在課題組前期工作中,我們通過(guò)噬菌體展示技術(shù)獲得與人高轉(zhuǎn)移前列腺癌細(xì)胞系PC-3M特異性結(jié)合的短肽B04,繼而反向釣取篩選獲得PC-3M細(xì)胞膜上與B04特異性結(jié)合的目標(biāo)蛋白ATP5B^[1]。ATP5B通常表達(dá)于線粒體內(nèi)膜,在某些細(xì)胞中可以異位表達(dá)于細(xì)胞膜,其功能和異位途經(jīng)尚不明確,且ATP5B的異位表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移能力有相關(guān)聯(lián)系。因此,為闡明腫瘤細(xì)胞膜表面ATP5B的具體來(lái)源并有效抑制ATP5B的異位表達(dá),本研究擬采用特異性ATP5B配體短肽B04,通過(guò)脂質(zhì)體被細(xì)胞攝取的獨(dú)特機(jī)制,建立一種使短肽B04只與線粒體ATP5B結(jié)合而不與細(xì)胞膜ATP5B結(jié)合的方法,特異性封閉線粒體ATP5B,通過(guò)蛋白印跡法觀察細(xì)胞膜表面ATP5B異位表達(dá)是否有效下降,從而抑制ATP5B的異位表達(dá)。方法:1.制備短肽B04并驗(yàn)證其是否具備噬菌體表面同序列短肽相同的功能根據(jù)短肽序列合成一批短肽B04,將制得B04與PC-3M細(xì)胞共孵育,通過(guò)細(xì)胞免疫熒光化學(xué)以及蛋白印跡法檢測(cè)B04與ATP5B的結(jié)合能力。2.制備包裹短肽B04的脂質(zhì)體并建立B04的HPLC檢測(cè)方法（1）通過(guò)逆相蒸發(fā)法制備包裹B0... 

【文章來(lái)源】：吉林大學(xué)吉林省211工程院校985工程院校教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：49 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

1短肽B04封閉細(xì)胞膜ATP5B熒光圖（****p<0.0001，n=3）

吉林大學(xué)碩士學(xué)位論文20圖3.1.2短肽B04封閉ATP5B蛋白印跡圖（***p<0.001，n=3）A:Westernblot檢測(cè)PC-3M,PC-3M+200ug/mLB04封閉后ATP5B蛋白表達(dá)B:PC-3M,PC-3M+200ug/mLB04封閉后ATP5B蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果3.2合成B04脂質(zhì)體并驗(yàn)證其性能3.2.1HPLC建立B04標(biāo)準(zhǔn)曲線我們采用HPLC來(lái)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用的是DAD檢測(cè)器檢測(cè)B04標(biāo)準(zhǔn)品溶液在220nm下的吸光度，并根據(jù)其峰面積和樣品濃度，我們可以建立出標(biāo)準(zhǔn)曲線公式y(tǒng)=77.08*x+7.139，并算出R方大于0.999。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下圖所示：表3.2.1B04標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度梯度及HPLC峰面積圖3.2.1B04標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線3.2.2HPLC檢測(cè)B04脂質(zhì)體包封率包封率是檢測(cè)脂質(zhì)體包裹情況的重要參數(shù)，越高的包封率代表著藥物在脂質(zhì)體內(nèi)包裹的量越多，相對(duì)分布在溶液中的藥物就會(huì)少。我們通過(guò)游離B04的峰面積和B04標(biāo)準(zhǔn)品樣品濃度（ug/mL）01.252.5510203040峰面積（mAU*s）085183387813155623073075

第3章結(jié)果21破乳B04的峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，計(jì)算出相應(yīng)濃度再通過(guò)包封率公式得出采用逆向蒸發(fā)法所制備的B04脂質(zhì)體的包封率為44.1%，處于正常水平。圖3.2.2短肽B04吸收峰圖A:游離短肽B04的吸收峰圖B:破乳后總短肽B04的吸收峰圖3.3B04脂質(zhì)體對(duì)PC-3M細(xì)胞的影響3.3.1ATP生成檢測(cè)試劑盒檢測(cè)B04脂質(zhì)體對(duì)PC-3M細(xì)胞ATP生成的影響在我們研究B04脂質(zhì)體對(duì)線粒體上ATP5B異位表達(dá)的影響之前，我們需要先驗(yàn)證該脂質(zhì)體及其包裹藥物含量對(duì)ATP合酶的功能沒(méi)有影響，即ATP生成不能受損。因此，我們使用ATP生成檢測(cè)試劑盒檢測(cè)在使用B04脂質(zhì)體后，PC-3M細(xì)胞胞內(nèi)ATP生成的是否有明顯變化。實(shí)驗(yàn)分組為空白PC-3M組（不加B04脂質(zhì)體）、加脂質(zhì)體空載體PC-3M組、加梯度B04脂質(zhì)體PC-3M組（10-100ug/mL），以PC-3M組作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下圖所示，空載體組相對(duì)于對(duì)照組沒(méi)有明顯的變化，說(shuō)明空載脂質(zhì)體對(duì)ATP生成沒(méi)有影響；10-50ug/mL濃度組相對(duì)于對(duì)照組沒(méi)有明顯的變化，100ug/mL濃度組相對(duì)于對(duì)照組有輕微下降，不過(guò)并無(wú)統(tǒng)計(jì)性差異（p>0.05），因此說(shuō)明較低濃度進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的B04短肽并不影響胞內(nèi)ATP合酶的功能。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]2013年中國(guó)老年人群惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J]. 陳萬(wàn)青,鄭榮壽,張思維,曾紅梅,鄒小農(nóng),赫捷.  中華腫瘤雜志. 2017 (01)

博士論文
[1]人前列腺癌細(xì)胞特異性結(jié)合短肽的篩選及鑒定[D]. 夏陽(yáng).吉林大學(xué) 2007

碩士論文
[1]Cav-1在細(xì)胞膜異位表達(dá)ATP5B促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲過(guò)程中的作用研究[D]. 周莉娟.吉林大學(xué) 2019
[2]細(xì)胞膜表面ATP5B的表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力影響的研究[D]. 唐辰晨.吉林大學(xué) 2018
[3]ATP5B在細(xì)胞膜異位表達(dá)對(duì)人前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響及機(jī)制探究[D]. 常曉娜.吉林大學(xué) 2017
[4]短肽B04對(duì)前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白ATP5B特異性抑制作用的研究[D]. 李改云.吉林大學(xué) 2016



本文編號(hào)：3618993