目的探討依他尼酸（ethacrynic acid,EA）殺傷肺癌A549細(xì)胞球的作用及機制研究。方法無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)A549細(xì)胞球,應(yīng)用Western blot檢測CD133、SOX2、Ep CAM和ABCG2的蛋白表達(dá)水平。應(yīng)用1、2、5、10、20 mg/m L的濃度順鉑（cisplatin,DDP）分別處理A549及細(xì)胞球48 h,用MTT檢測48 h內(nèi)細(xì)胞的存活率。應(yīng)用比色法檢測10、50、100、200μmol/L EA對A549細(xì)胞球中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase,GST）活性的抑制作用。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、Western blot、Real-timePCR、相差顯微鏡觀察檢測200μmol/L EA處理A549細(xì)胞球前后ROS水平、細(xì)胞成球能力、β-catenin、Sox2和ABCG2 mRNA和蛋白以及β-catenin啟動子活性的變化情況。應(yīng)用β-catenin腺病毒感染A549細(xì)胞球后,再用200μmol/L EA的處理A549細(xì)胞球,利用Real-time PCR和Western blot檢測β-catenin S、Sox2... 

【文章來源】：第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報. 2017,39(17)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

相差顯微鏡觀察A549細(xì)胞克隆及A549細(xì)胞球

胞球(圖1)。A549細(xì)胞球中CD133、EpCAM、SOX2以及ABCG2的表達(dá)水平較A549細(xì)胞顯著升高(圖2)。用不同濃度的DDP分別處理A549細(xì)胞球和A549細(xì)胞，隨著濃度的增加，與A549細(xì)胞的細(xì)胞活力0h比較，顯著下調(diào)(P＜0.05)，而A549細(xì)胞球的細(xì)胞活力無顯著變化(P＞0.05，圖3)。此外，基于我們的前期研究［4－5］，后續(xù)實驗我們將使用5mg/mL的DDP處理A549細(xì)胞球。A:A549細(xì)胞形成的克隆藍(lán)色箭頭為緊密型克隆，綠色箭頭為疏松型克隆;B:A549細(xì)胞球圖1相差顯微鏡觀察A549細(xì)胞克隆及A549細(xì)胞球變化(×200)1:A549細(xì)胞球;2:A549細(xì)胞圖2Westernblot檢測A549細(xì)胞球和A549細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、EpCAM、SOX2以及ABCG2的表達(dá)水平2．2EA對A549細(xì)胞球中GST活性和ＲOS水平的影響隨著EA濃度從10μmol/L到200μmol/L逐漸升高，A549細(xì)胞球中GST的活性逐漸降低(圖4，P＜0.05)。由于200μmol/LEA處理使GST活性降至最低，因此后續(xù)實驗EA均使用200μmol/L的濃度對A549細(xì)胞球進(jìn)行處理。我們用200μmol/LEA處理A549細(xì)胞球48h后用流式細(xì)胞儀檢測ＲOS水平(圖5)，EA處理組(240．0±3．6)，對照組(142．7±2.4)。EA處理組較對照組的ＲOS水平顯著升高(P＜0.01)。上述結(jié)果說明EA可以特異性抑制GST的活性，并上調(diào)ＲOS水平。a:P＜0.05，與DDP處理0h比較圖3CCK-8檢測不同濃度DDP分別處理A549細(xì)胞球和A549細(xì)胞48h后細(xì)胞存活率變化1:對照組，2:10μmol/LEA組，3:50μmol/LEA組，4:100μmol/LEA組，5:200μmol/LEA組a:P＜0.05，與對照組比較;b:P＜0.05，與10μmol/LEA組比較;c:P＜0.05，與50μmol/LEA組比較;d:P＜0.05，與100μmol/LEA組比較圖4不同濃度EA處理A549細(xì)胞球48h后GST活性的變化圖5流式細(xì)胞術(shù)檢測200μmol/LEA處理A549細(xì)胞球48h后DCFH的熒光強度(?

鎪??2．2EA對A549細(xì)胞球中GST活性和ＲOS水平的影響隨著EA濃度從10μmol/L到200μmol/L逐漸升高，A549細(xì)胞球中GST的活性逐漸降低(圖4，P＜0.05)。由于200μmol/LEA處理使GST活性降至最低，因此后續(xù)實驗EA均使用200μmol/L的濃度對A549細(xì)胞球進(jìn)行處理。我們用200μmol/LEA處理A549細(xì)胞球48h后用流式細(xì)胞儀檢測ＲOS水平(圖5)，EA處理組(240．0±3．6)，對照組(142．7±2.4)。EA處理組較對照組的ＲOS水平顯著升高(P＜0.01)。上述結(jié)果說明EA可以特異性抑制GST的活性，并上調(diào)ＲOS水平。a:P＜0.05，與DDP處理0h比較圖3CCK-8檢測不同濃度DDP分別處理A549細(xì)胞球和A549細(xì)胞48h后細(xì)胞存活率變化1:對照組，2:10μmol/LEA組，3:50μmol/LEA組，4:100μmol/LEA組，5:200μmol/LEA組a:P＜0.05，與對照組比較;b:P＜0.05，與10μmol/LEA組比較;c:P＜0.05，與50μmol/LEA組比較;d:P＜0.05，與100μmol/LEA組比較圖4不同濃度EA處理A549細(xì)胞球48h后GST活性的變化圖5流式細(xì)胞術(shù)檢測200μmol/LEA處理A549細(xì)胞球48h后DCFH的熒光強度(胞內(nèi)ＲOS水平)http://aammt．tmmu．edu．cn第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2017，39(17)1723

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Beyond tumorigenesis: cancer stem cells in metastasis[J]. Benjamin Tiede,JoanMassagué.  Cell Research. 2007(01)



本文編號：3596767