[目的]檢測新型雌激素受體GPER1在肺癌細(xì)胞中的表達(dá);并進(jìn)一步探討GPER1對EGFR-TKIs耐藥的肺癌細(xì)胞的增殖作用。[方法]運用Q-PCR方法比較GPER1和ERβ在肺癌細(xì)胞A549、PC-9和乳腺癌細(xì)胞MCF-7（陽性對照）中的表達(dá),并構(gòu)建對TKIs耐藥的肺癌PC9-GR、PC9-OR細(xì)胞株,使用PCR及ddPCR法檢測構(gòu)建的耐藥細(xì)胞株中EGFR突變情況。應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測GPER1在PC9、PC9-GR及PC9-OR細(xì)胞中表達(dá)位置的變化。為深入探討新型雌激素受體GPER1在耐藥過程中的作用,本研究還通過蛋白質(zhì)印跡法（western blot）檢測了 E2、G1對GPER1在肺癌細(xì)胞A549、PC9-OR中表達(dá)的影響;運用細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8（Cell Counting Kit-8,CCK-8）檢測了雌激素受體GPER1對肺癌細(xì)胞A549、PC9-OR增殖的影響。[結(jié)果]1.Q-PCR法檢測到在mRNA水平,GPER1和ERβ在A549細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于PC-9細(xì)胞,且表達(dá)水平接近MCF-7細(xì)胞。2.PCR和ddPCR測序法對肺癌細(xì)胞株P(guān)C9、PC9-GR、PC9-OR進(jìn)行... 

【文章來源】：昆明醫(yī)科大學(xué)云南省

【文章頁數(shù)】：54 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１Ａ?ＥＲｐ在Ａ５４９、ＰＣ９和ＭＣＦ－７細(xì)胞中的表達(dá)??Ｆｉｇｌ?Ａ?Ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＥＲｐ?ｉｎ?Ａ５４９＞?ＰＣ９?ａｎｄ?ＭＣＦ－７?ｃｅｌｌｓ??

２構(gòu)建對ＴＫＩｓ耐藥的肺癌細(xì)胞株??２．１在倒置相差顯微鏡下觀察構(gòu)建的耐藥細(xì)胞株形態(tài)變化??在倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：ＰＣ９，?ＰＣ９－ＧＲ細(xì)胞株呈集落樣生長，細(xì)胞體??積較小，彼此相連聚集成團，外形呈卵圓扁平狀，生長速度呈對數(shù)生長，具有典??型的上皮樣細(xì)胞形態(tài)；而與前兩者相比，加藥誘導(dǎo)六個月后的ＰＣ９－０Ｒ細(xì)胞形態(tài)??發(fā)生了明顯變化，細(xì)胞分散生長，胞質(zhì)區(qū)域明顯，體積顯著變大，有偽足，見下??圖。??ＰＣ９?（２００Ｘ）?ＰＣ９－ＧＲ?（２００Ｘ）?ＰＣ９－ＯＲ（２００Ｘ）??圖２?ＰＣ９、ＰＣ９－ＧＲ、ＰＣ９－０Ｒ的細(xì)胞形態(tài)??Ｆｉｇ?２?ｃｅｌｌ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?ＰＣ９、ＰＣ９－ＧＲ、ＰＣ９－ＯＲ??２．２使用ＰＣＲ測序法檢測肺癌ＰＣ９、ＰＣ９－ＧＲ、ＰＣ９－ＯＲ細(xì)胞株的ＥＧＦＲ１８－２１??外顯子序列??根據(jù)ＰＣＲ測序法的檢測結(jié)果可知，ＰＣ９、ＰＣ９－ＧＲ、ＰＣ９－０Ｒ三株細(xì)胞中１９??外顯子的２４９２－２５０６位點均發(fā)生了突變?nèi)笔В缦聢D。我們在細(xì)胞培養(yǎng)過程中運??用ＣＣＫ－８法檢測到ＰＣ９－ＧＲ、ＰＣ９－ＯＲ分別對吉非替尼和奧西替尼產(chǎn)生了耐藥，??由于ＰＣＲ測序法只能檢測到突變豐度大于１０％？２０％的突變，為了進(jìn)一步檢測在??這三個細(xì)胞株中是否發(fā)生了最常見的Ｔ７９０Ｍ耐藥突變，我們運用了精確度更高??的ｄｄＰＣＲ?（可以檢測到突變豐度０．１％的突變）來檢測其突變情況。??２８??

３新型雌激素受體ＧＰＥＲ１對肺癌耐藥細(xì)胞Ａ５４９、ＰＣ９－ＯＲ增殖的影響??３．１用免疫熒光技術(shù)檢測ＧＰＥＲ１在肺癌細(xì)胞ＰＣ９、ＰＣ９－ＧＲ及ＰＣ９－ＯＲ中的表??達(dá)??采用免疫熒光顯微鏡（２０Ｘ）觀察了雌激素受體ＧＰＥＲ１在肺癌ＰＣ９、ＰＣ９－ＧＲ??及ＰＣ９－０Ｒ細(xì)胞株中的表達(dá)情況，我們發(fā)現(xiàn)在ＰＣ９、ＰＣ９－ＧＲ細(xì)胞中ＧＰＥＲ１均??表達(dá)于細(xì)胞核中；而在ＰＣ９－ＯＲ細(xì)胞株中ＧＰＥＲ１表達(dá)于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中，見??下圖。??ＰＣ９（２００Ｘ）?ＰＣ９－ＧＲ（２００Ｘ）?ＰＣ９－ＯＲ（２００Ｘ）??圖４?ＧＰＥＲ１在ＰＣ９、ＰＣ９－ＧＲ及ＰＣ９－０Ｒ細(xì)胞中的表達(dá)及分布??Ｆｉｇ?４?Ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ａｎｄ?ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ?ｏｆ?ＧＰＥＲ１?ｉｎ?ＰＣ９＞?ＰＣ９－ＧＲ?ａｎｄ?ＰＣ９－０Ｒ?ｃｅｌｌｓ??３．２應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法（ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ方法）檢測Ｅ２及Ｇ１對肺癌細(xì)胞Ａ５４９、??ＰＣ９－ＯＲ細(xì)胞株中ＧＰＥＲ１表達(dá)影響??免疫蛋白印跡法（ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ方法）檢測結(jié)果表明，Ｇｌ、Ｅ２均促進(jìn)肺癌細(xì)??胞株Ａ５４９、ＰＣ９－０Ｒ中的ＧＰＥＲ１的表達(dá)，見下圖。Ｇ１對ＧＰＥＲ１的表達(dá)具有??時間依耐性，在Ａ５４９細(xì)胞株中４８小時比２４小時表達(dá)高，而在ＰＣ９－ＯＲ細(xì)胞株??中２４小時比４８小時表達(dá)高（Ｐ＜０．５，有統(tǒng)計學(xué)意義）；Ｅ２對ＧＰＥＲ１的表達(dá)影響??在０－２４小時隨時間變化不明顯，在Ａ５４９細(xì)胞株中２４、４８小時表達(dá)幾乎齊平，??且在ＰＣ９－ＯＲ細(xì)胞株中２４小時與４８小時也無明顯差異（Ｐ＜０．５）。??３０??


本文編號：3478481