目的:本實(shí)驗(yàn)擬1、研究肝癌組織、癌旁組織和良性肝組織中TMEM16A蛋白水平的表達(dá)差異,在肝癌組織和癌旁組織中研究TMEM16Am RNA水平表達(dá)差異;2、在肝癌細(xì)胞系SMMC-7721中轉(zhuǎn)入TMEM16A過表達(dá)質(zhì)粒并研究TMEM16A過表達(dá)對(duì)肝臟腫瘤細(xì)胞的增殖能力、遷移能力和凋亡能力的影響。3、研究肝癌組織和癌旁組織的TMEM16A基因啟動(dòng)子Cp G島甲基化程度并在SMMC-7721中研究去甲基化藥物5-氮雜-2脫氧胞苷處理對(duì)TMEM16A蛋白表達(dá)水平和TMEM16Am RNA表達(dá)水平的影響。方法:1、本課題收集青島大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽胰外科40例肝癌切除術(shù)患者的肝癌組織及其癌旁組織40對(duì)和6例肝良性病變,利用western blot方法研究TMEM16A蛋白在肝癌組織、癌旁組織和肝臟良性組織中的表達(dá)水平,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法研究TMEM16Am RNA在肝癌組織和癌旁組織中表達(dá)水平;2、通過在肝癌細(xì)胞系SMMC-7721中轉(zhuǎn)入TMEM16A過表達(dá)質(zhì)粒p EGFP-TMEM16A和pc DNA3.1-TMEM16A和相應(yīng)對(duì)照空載p EGFP-N1和pc DNA3.1,使用MTT比色... 

【文章來源】：青島大學(xué)山東省

【文章頁(yè)數(shù)】：48 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

TMEM16A在肝癌中低表達(dá)AWesternblot檢測(cè)TMEM16A蛋白在肝組織中的表達(dá)

為了研究 TMEM16A 在肝癌細(xì)胞中對(duì)細(xì)胞功能的影響，我們首先研究 SMM721 中 TMEM16A 蛋白表達(dá)水平，已有學(xué)者發(fā)現(xiàn) TMEM16A 在乳腺癌組織和乳細(xì)胞系 MDA-MB-231 中高表達(dá)[17]。通過 western blot 我們比較了 SMMC-7721 和DA-MB-231 中 TMEM16A 蛋白表達(dá)水平，我們發(fā)現(xiàn)相比于乳腺癌細(xì)胞 SMMC-細(xì)胞的 TMEM16A 明顯低表達(dá)（圖 2A）。我們利用 Lipofectamine 3000 對(duì)肝癌系 SMMC-7721 進(jìn)行 pEGFP-TMEM16A 和 pcDNA3.1-TMEM16A 或相應(yīng)空載 pP-N1 和 pcDNA3.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。使用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（n=5，相對(duì) mRNA 表達(dá)倍SMMC-7721 vs pcDNA3.1 vs pcDNA3.1- TMEM16A， 1±0 vs 1.236±0.0983 v3.219±387.947，p＜0.001；n=5，SMMC-7721 vs pEGFP-N1 vs pEGFP-TMEM11±0 vs 1.520±0.223 vs 1563.587±590.934，p＜0.001，圖 2B）和 western blot2C）檢測(cè) SMMC-7721 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后 TMEM16A 的表達(dá)。在轉(zhuǎn)染 pEGFP-TMEM和相應(yīng)空載 0、24 和 48 小時(shí)后進(jìn)行 MTT 實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)。MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明染 pEGFP-TMEM16A 的 SMMC-7721 細(xì)胞增殖受到明顯抑制 (n=18，490nmOD1.473±0.022 vs 1.333±0.027，p＜0.001，圖 3A）。但是劃痕實(shí)驗(yàn)顯示 TMEM16過表達(dá)并沒有對(duì)細(xì)胞的遷移產(chǎn)生明顯改變（圖 3B）。

圖 3. TMEM16A 在 SMMC-7721 細(xì)胞中過表達(dá)抑制細(xì)胞增殖A. MTT 實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染 pEGFP-TMEM16A48 小時(shí)后，SMMC-7721 細(xì)胞的增殖能力明顯減弱。1指示 pEGFP-N1 轉(zhuǎn)染；2 指示 pEGFP-TMEM16A 轉(zhuǎn)染。B.劃痕實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染 pEGFP-TMEM16A后，細(xì)胞遷移能力無明顯改變。放大倍數(shù) 200；圖中黑線鏡下長(zhǎng)度為 20 微米。3 TMEM16A 的過表達(dá)引起肝癌細(xì)胞系 SMMC-7721 的凋亡。在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn) TMEM16A 表達(dá)質(zhì)粒顯著地改變了細(xì)胞的形態(tài)，異常細(xì)胞呈現(xiàn)變圓皺縮等類似凋亡的形態(tài)（圖 24A），我們?cè)谵D(zhuǎn)染后 24、48 和 72 小時(shí)后分別隨機(jī)拍照空載和過表達(dá)組細(xì)胞圖片各 10 張并且對(duì)異常細(xì)胞計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)異常細(xì)胞所占百分比，我們發(fā)現(xiàn) TMEM16A 表達(dá)質(zhì)粒使異常細(xì)胞百分比明顯提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=10，p＜0.001，圖 4B）。我們推測(cè) TMEM16A 過表達(dá)可能具有促進(jìn)凋亡的作用。為了驗(yàn)證這一推測(cè)，我們使用 Lipofectamine 3000 在 SMMC-7721 細(xì)胞中轉(zhuǎn)入 pcDNA3.1 和 pcDNA3.1-TMEM16A 質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染 24 小時(shí)后我們通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行 Annexin V-FITC 和 PI 雙染凋亡檢測(cè)。同時(shí)為了排除 Lipofectamine 3000 可能的細(xì)胞毒性干擾我們還檢驗(yàn)了不加入質(zhì)粒但加入同等量 Lipofectamine 3000 的空

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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