目的:本實驗擬1、研究肝癌組織、癌旁組織和良性肝組織中TMEM16A蛋白水平的表達差異,在肝癌組織和癌旁組織中研究TMEM16Am RNA水平表達差異;2、在肝癌細胞系SMMC-7721中轉入TMEM16A過表達質粒并研究TMEM16A過表達對肝臟腫瘤細胞的增殖能力、遷移能力和凋亡能力的影響。3、研究肝癌組織和癌旁組織的TMEM16A基因啟動子Cp G島甲基化程度并在SMMC-7721中研究去甲基化藥物5-氮雜-2脫氧胞苷處理對TMEM16A蛋白表達水平和TMEM16Am RNA表達水平的影響。方法:1、本課題收集青島大學附屬醫(yī)院肝膽胰外科40例肝癌切除術患者的肝癌組織及其癌旁組織40對和6例肝良性病變,利用western blot方法研究TMEM16A蛋白在肝癌組織、癌旁組織和肝臟良性組織中的表達水平,利用實時熒光定量PCR方法研究TMEM16Am RNA在肝癌組織和癌旁組織中表達水平;2、通過在肝癌細胞系SMMC-7721中轉入TMEM16A過表達質粒p EGFP-TMEM16A和pc DNA3.1-TMEM16A和相應對照空載p EGFP-N1和pc DNA3.1,使用MTT比色... 

【文章來源】：青島大學山東省

【文章頁數(shù)】：48 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

TMEM16A在肝癌中低表達AWesternblot檢測TMEM16A蛋白在肝組織中的表達

為了研究 TMEM16A 在肝癌細胞中對細胞功能的影響，我們首先研究 SMM721 中 TMEM16A 蛋白表達水平，已有學者發(fā)現(xiàn) TMEM16A 在乳腺癌組織和乳細胞系 MDA-MB-231 中高表達[17]。通過 western blot 我們比較了 SMMC-7721 和DA-MB-231 中 TMEM16A 蛋白表達水平，我們發(fā)現(xiàn)相比于乳腺癌細胞 SMMC-細胞的 TMEM16A 明顯低表達（圖 2A）。我們利用 Lipofectamine 3000 對肝癌系 SMMC-7721 進行 pEGFP-TMEM16A 和 pcDNA3.1-TMEM16A 或相應空載 pP-N1 和 pcDNA3.1 質粒轉染。使用實時熒光定量 PCR（n=5，相對 mRNA 表達倍SMMC-7721 vs pcDNA3.1 vs pcDNA3.1- TMEM16A， 1±0 vs 1.236±0.0983 v3.219±387.947，p＜0.001；n=5，SMMC-7721 vs pEGFP-N1 vs pEGFP-TMEM11±0 vs 1.520±0.223 vs 1563.587±590.934，p＜0.001，圖 2B）和 western blot2C）檢測 SMMC-7721 轉染質粒后 TMEM16A 的表達。在轉染 pEGFP-TMEM和相應空載 0、24 和 48 小時后進行 MTT 實驗和劃痕實驗。MTT 實驗結果表明染 pEGFP-TMEM16A 的 SMMC-7721 細胞增殖受到明顯抑制 (n=18，490nmOD1.473±0.022 vs 1.333±0.027，p＜0.001，圖 3A）。但是劃痕實驗顯示 TMEM16過表達并沒有對細胞的遷移產生明顯改變（圖 3B）。

圖 3. TMEM16A 在 SMMC-7721 細胞中過表達抑制細胞增殖A. MTT 實驗顯示轉染 pEGFP-TMEM16A48 小時后，SMMC-7721 細胞的增殖能力明顯減弱。1指示 pEGFP-N1 轉染；2 指示 pEGFP-TMEM16A 轉染。B.劃痕實驗顯示轉染 pEGFP-TMEM16A后，細胞遷移能力無明顯改變。放大倍數(shù) 200；圖中黑線鏡下長度為 20 微米。3 TMEM16A 的過表達引起肝癌細胞系 SMMC-7721 的凋亡。在實驗中我們發(fā)現(xiàn) TMEM16A 表達質粒顯著地改變了細胞的形態(tài)，異常細胞呈現(xiàn)變圓皺縮等類似凋亡的形態(tài)（圖 24A），我們在轉染后 24、48 和 72 小時后分別隨機拍照空載和過表達組細胞圖片各 10 張并且對異常細胞計數(shù)并統(tǒng)計異常細胞所占百分比，我們發(fā)現(xiàn) TMEM16A 表達質粒使異常細胞百分比明顯提高，差異具有統(tǒng)計學意義（n=10，p＜0.001，圖 4B）。我們推測 TMEM16A 過表達可能具有促進凋亡的作用。為了驗證這一推測，我們使用 Lipofectamine 3000 在 SMMC-7721 細胞中轉入 pcDNA3.1 和 pcDNA3.1-TMEM16A 質粒，轉染 24 小時后我們通過流式細胞儀進行 Annexin V-FITC 和 PI 雙染凋亡檢測。同時為了排除 Lipofectamine 3000 可能的細胞毒性干擾我們還檢驗了不加入質粒但加入同等量 Lipofectamine 3000 的空

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3423795