目的研究微小RNA-503-5p（miR-503-5p）對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞和EJ細(xì)胞生長的影響和機(jī)制。方法 T24細(xì)胞和EJ細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-503-5p模擬物或陰性對(duì)照微小RNA（miR-NC）并驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率,生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-503-5p的靶基因。通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-503-5p靶基因E2F轉(zhuǎn)錄因子3（E2F3）及下游基因mRNA的表達(dá)水平,Western blot法檢測(cè)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）/E2F信號(hào)通路蛋白E2F3、細(xì)胞周期蛋白E（cyclin E）、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶2（CDK2）、Rb和磷酸化的Rb（p-Rb）蛋白水平,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞周期的變化,MTT法和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果轉(zhuǎn)染miR-503-5p模擬物后,膀胱癌細(xì)胞中miR-503-5p的水平顯著增加。過表達(dá)miR-503-5p可明顯降低膀胱癌細(xì)胞中E2F3mRNA及Rb/E2F信號(hào)通路基因的表達(dá)水平,將膀胱癌細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期,膀胱癌細(xì)胞的增殖能力明顯降低。結(jié)論過表達(dá)miR-503-5p通過干擾Rb/E2F信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo),抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖。 

【文章來源】：細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志. 2017,33(10)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

轉(zhuǎn)染后各組中miＲ-503-5p表達(dá)量檢測(cè)

、CDK2和p-Ｒb蛋白的表達(dá)均明顯下調(diào)，Ｒb總蛋白表達(dá)基本相當(dāng)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05，圖3)。表2膀胱癌細(xì)胞Ｒb/E2F信號(hào)通路分子的mＲNA表達(dá)水平(n=4，%，x±s)細(xì)胞分組E2F3CyclinECDK2ＲbT24miＲ-NC1．06±0．441．00±0．041．00±0．051．21±0．77miＲ-503-5p0．43±0．12a0．34±0．10b0．65±0．17b1．13±0．60EJmiＲ-NC1．00±0．051．03±0．321．00±0．111．26±0．96miＲ-503-5p0．53±0．15b0．60±0．14a0．65±0．07b1．06±0．38aP＜0．05，bP＜0．01vsmiＲ-NC．圖3Westernblot法檢測(cè)Ｒb/E2F信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況2．5過表達(dá)miＲ-503-5p的T24細(xì)胞和EJ細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期與對(duì)照組相比，過表達(dá)miＲ-503-5p后，T24和EJ細(xì)胞位于G0/G1期的細(xì)胞比例顯著上升，S期和G2期細(xì)胞比例明顯下降(P＜0．05，表3)，提示miＲ-503-5p可抑制膀胱癌細(xì)胞周期的進(jìn)展。表3miＲ-503-5p對(duì)膀胱癌細(xì)胞周期的影響(n=4，%，x±s)細(xì)胞分組G0/G1SG2/MT24miＲ-NC45．2±3．3835．18±2．6319．61±1．52miＲ-503-5p63．25±4．86b25．17±1．93b11．58±2．93bEJmiＲ-NC48．77±9．0832．55±6．0618．67±3．21miＲ-503-5p65．29±5．58a22．17±1．89a12．54±3．72aaP＜0．05，bP＜0．01vsmiＲ-NC．2．6過表達(dá)miＲ-503-5p抑制T24細(xì)胞和EJ細(xì)胞的增殖與對(duì)照組相比(圖4)，過表達(dá)miＲ-503-5p后，T24細(xì)胞由第5天開始增殖能力明顯下降(P＜0．05)，EJ細(xì)胞由第3天開始增殖能力明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，提示miＲ-503-5p可抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖能力。1362細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志(ChinJCellMolImmunol)2017，33(10)

aP＜0．05vsmiＲ-NC．圖4MTT檢測(cè)各組膀胱癌細(xì)胞增殖情況2．7過表達(dá)miＲ-503-5p抑制T24細(xì)胞和EJ細(xì)胞的集落形成能力與對(duì)照組相比，過表達(dá)miＲ-503-5p后，T24和EJ細(xì)胞形成的克隆數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05，圖5)，提示miＲ-503-5p可抑制膀胱癌細(xì)胞的集落形成能力。aP＜0．05vsmiＲ-NC．圖5集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組膀胱癌細(xì)胞增殖能力3討論miＲNA是一類內(nèi)源性的非編碼ＲNA，通過與靶基因mＲNA3'非翻譯區(qū)(3'-untranslatedregion，3'UTＲ)相結(jié)合，可引起靶基因mＲNA的降解或者抑制其翻譯，屬于轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)［10－12］。miＲNA廣泛參與機(jī)體多種細(xì)胞功能如增殖、分化、衰老、凋亡等的變化，引起機(jī)體多種生理和病理改變，并且與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［13－14］。近年來，miＲNA已成為疾病分子研究的熱點(diǎn)［15－16］。miＲ-503-5p是一種新發(fā)現(xiàn)的具有腫瘤抑制作用的miＲNA，可顯著抑制乳腺癌、宮頸癌、非小細(xì)胞肺癌和結(jié)直腸癌等多種腫瘤的生長［17－20］。然而，miＲ-503-5p對(duì)膀胱癌細(xì)胞生長的影響未見報(bào)道。我們通過miＲNA靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站TargetScan和microＲNA．org，并參考文獻(xiàn)報(bào)道［20］，確定E2F3基因?yàn)閙iＲ-503-5p的靶基因。E2F3基因?qū)儆谵D(zhuǎn)錄因子E2F家族，具有促進(jìn)細(xì)胞由G0/G1向S期轉(zhuǎn)換的作用，參與細(xì)胞周期的調(diào)控［21－23］。有研究表明，E2F3基因在膀胱癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)［24］，通過干擾E2F3基因的表達(dá)抑制膀胱癌的發(fā)生發(fā)展具有重要的研究意義。本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miＲ-503-5p至膀胱癌細(xì)胞后，E2F3基因的表達(dá)水平顯著下調(diào)，表明miＲ-503-5p可顯著抑制E2F3基因的表達(dá)。E2F3基因通過激活下游蛋白cyclinE的表達(dá)，使得cyclinE-CDK2激酶復(fù)合物形成增加，導(dǎo)致


本文編號(hào)：3411491