miR-503-5p通過干擾Rb/E2F信號(hào)通路抑制膀胱癌T24和EJ細(xì)胞的增殖
發(fā)布時(shí)間:2021-09-28 07:29
目的研究微小RNA-503-5p(miR-503-5p)對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞和EJ細(xì)胞生長的影響和機(jī)制。方法 T24細(xì)胞和EJ細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-503-5p模擬物或陰性對(duì)照微小RNA(miR-NC)并驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率,生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-503-5p的靶基因。通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-503-5p靶基因E2F轉(zhuǎn)錄因子3(E2F3)及下游基因mRNA的表達(dá)水平,Western blot法檢測(cè)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(Rb)/E2F信號(hào)通路蛋白E2F3、細(xì)胞周期蛋白E(cyclin E)、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶2(CDK2)、Rb和磷酸化的Rb(p-Rb)蛋白水平,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞周期的變化,MTT法和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果轉(zhuǎn)染miR-503-5p模擬物后,膀胱癌細(xì)胞中miR-503-5p的水平顯著增加。過表達(dá)miR-503-5p可明顯降低膀胱癌細(xì)胞中E2F3mRNA及Rb/E2F信號(hào)通路基因的表達(dá)水平,將膀胱癌細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期,膀胱癌細(xì)胞的增殖能力明顯降低。結(jié)論過表達(dá)miR-503-5p通過干擾Rb/E2F信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo),抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖。
【文章來源】:細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志. 2017,33(10)北大核心CSCD
【文章頁數(shù)】:5 頁
【部分圖文】:
轉(zhuǎn)染后各組中miR-503-5p表達(dá)量檢測(cè)
、CDK2和p-Rb蛋白的表達(dá)均明顯下調(diào),Rb總蛋白表達(dá)基本相當(dāng),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖3)。表2膀胱癌細(xì)胞Rb/E2F信號(hào)通路分子的mRNA表達(dá)水平(n=4,%,x±s)細(xì)胞分組E2F3CyclinECDK2RbT24miR-NC1.06±0.441.00±0.041.00±0.051.21±0.77miR-503-5p0.43±0.12a0.34±0.10b0.65±0.17b1.13±0.60EJmiR-NC1.00±0.051.03±0.321.00±0.111.26±0.96miR-503-5p0.53±0.15b0.60±0.14a0.65±0.07b1.06±0.38aP<0.05,bP<0.01vsmiR-NC.圖3Westernblot法檢測(cè)Rb/E2F信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況2.5過表達(dá)miR-503-5p的T24細(xì)胞和EJ細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期與對(duì)照組相比,過表達(dá)miR-503-5p后,T24和EJ細(xì)胞位于G0/G1期的細(xì)胞比例顯著上升,S期和G2期細(xì)胞比例明顯下降(P<0.05,表3),提示miR-503-5p可抑制膀胱癌細(xì)胞周期的進(jìn)展。表3miR-503-5p對(duì)膀胱癌細(xì)胞周期的影響(n=4,%,x±s)細(xì)胞分組G0/G1SG2/MT24miR-NC45.2±3.3835.18±2.6319.61±1.52miR-503-5p63.25±4.86b25.17±1.93b11.58±2.93bEJmiR-NC48.77±9.0832.55±6.0618.67±3.21miR-503-5p65.29±5.58a22.17±1.89a12.54±3.72aaP<0.05,bP<0.01vsmiR-NC.2.6過表達(dá)miR-503-5p抑制T24細(xì)胞和EJ細(xì)胞的增殖與對(duì)照組相比(圖4),過表達(dá)miR-503-5p后,T24細(xì)胞由第5天開始增殖能力明顯下降(P<0.05),EJ細(xì)胞由第3天開始增殖能力明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示miR-503-5p可抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖能力。1362細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志(ChinJCellMolImmunol)2017,33(10)
aP<0.05vsmiR-NC.圖4MTT檢測(cè)各組膀胱癌細(xì)胞增殖情況2.7過表達(dá)miR-503-5p抑制T24細(xì)胞和EJ細(xì)胞的集落形成能力與對(duì)照組相比,過表達(dá)miR-503-5p后,T24和EJ細(xì)胞形成的克隆數(shù)量明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖5),提示miR-503-5p可抑制膀胱癌細(xì)胞的集落形成能力。aP<0.05vsmiR-NC.圖5集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組膀胱癌細(xì)胞增殖能力3討論miRNA是一類內(nèi)源性的非編碼RNA,通過與靶基因mRNA3'非翻譯區(qū)(3'-untranslatedregion,3'UTR)相結(jié)合,可引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻譯,屬于轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)[10-12]。miRNA廣泛參與機(jī)體多種細(xì)胞功能如增殖、分化、衰老、凋亡等的變化,引起機(jī)體多種生理和病理改變,并且與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13-14]。近年來,miRNA已成為疾病分子研究的熱點(diǎn)[15-16]。miR-503-5p是一種新發(fā)現(xiàn)的具有腫瘤抑制作用的miRNA,可顯著抑制乳腺癌、宮頸癌、非小細(xì)胞肺癌和結(jié)直腸癌等多種腫瘤的生長[17-20]。然而,miR-503-5p對(duì)膀胱癌細(xì)胞生長的影響未見報(bào)道。我們通過miRNA靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站TargetScan和microRNA.org,并參考文獻(xiàn)報(bào)道[20],確定E2F3基因?yàn)閙iR-503-5p的靶基因。E2F3基因?qū)儆谵D(zhuǎn)錄因子E2F家族,具有促進(jìn)細(xì)胞由G0/G1向S期轉(zhuǎn)換的作用,參與細(xì)胞周期的調(diào)控[21-23]。有研究表明,E2F3基因在膀胱癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)[24],通過干擾E2F3基因的表達(dá)抑制膀胱癌的發(fā)生發(fā)展具有重要的研究意義。本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-503-5p至膀胱癌細(xì)胞后,E2F3基因的表達(dá)水平顯著下調(diào),表明miR-503-5p可顯著抑制E2F3基因的表達(dá)。E2F3基因通過激活下游蛋白cyclinE的表達(dá),使得cyclinE-CDK2激酶復(fù)合物形成增加,導(dǎo)致
本文編號(hào):3411491
【文章來源】:細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志. 2017,33(10)北大核心CSCD
【文章頁數(shù)】:5 頁
【部分圖文】:
轉(zhuǎn)染后各組中miR-503-5p表達(dá)量檢測(cè)
、CDK2和p-Rb蛋白的表達(dá)均明顯下調(diào),Rb總蛋白表達(dá)基本相當(dāng),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖3)。表2膀胱癌細(xì)胞Rb/E2F信號(hào)通路分子的mRNA表達(dá)水平(n=4,%,x±s)細(xì)胞分組E2F3CyclinECDK2RbT24miR-NC1.06±0.441.00±0.041.00±0.051.21±0.77miR-503-5p0.43±0.12a0.34±0.10b0.65±0.17b1.13±0.60EJmiR-NC1.00±0.051.03±0.321.00±0.111.26±0.96miR-503-5p0.53±0.15b0.60±0.14a0.65±0.07b1.06±0.38aP<0.05,bP<0.01vsmiR-NC.圖3Westernblot法檢測(cè)Rb/E2F信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況2.5過表達(dá)miR-503-5p的T24細(xì)胞和EJ細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期與對(duì)照組相比,過表達(dá)miR-503-5p后,T24和EJ細(xì)胞位于G0/G1期的細(xì)胞比例顯著上升,S期和G2期細(xì)胞比例明顯下降(P<0.05,表3),提示miR-503-5p可抑制膀胱癌細(xì)胞周期的進(jìn)展。表3miR-503-5p對(duì)膀胱癌細(xì)胞周期的影響(n=4,%,x±s)細(xì)胞分組G0/G1SG2/MT24miR-NC45.2±3.3835.18±2.6319.61±1.52miR-503-5p63.25±4.86b25.17±1.93b11.58±2.93bEJmiR-NC48.77±9.0832.55±6.0618.67±3.21miR-503-5p65.29±5.58a22.17±1.89a12.54±3.72aaP<0.05,bP<0.01vsmiR-NC.2.6過表達(dá)miR-503-5p抑制T24細(xì)胞和EJ細(xì)胞的增殖與對(duì)照組相比(圖4),過表達(dá)miR-503-5p后,T24細(xì)胞由第5天開始增殖能力明顯下降(P<0.05),EJ細(xì)胞由第3天開始增殖能力明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示miR-503-5p可抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖能力。1362細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志(ChinJCellMolImmunol)2017,33(10)
aP<0.05vsmiR-NC.圖4MTT檢測(cè)各組膀胱癌細(xì)胞增殖情況2.7過表達(dá)miR-503-5p抑制T24細(xì)胞和EJ細(xì)胞的集落形成能力與對(duì)照組相比,過表達(dá)miR-503-5p后,T24和EJ細(xì)胞形成的克隆數(shù)量明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖5),提示miR-503-5p可抑制膀胱癌細(xì)胞的集落形成能力。aP<0.05vsmiR-NC.圖5集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組膀胱癌細(xì)胞增殖能力3討論miRNA是一類內(nèi)源性的非編碼RNA,通過與靶基因mRNA3'非翻譯區(qū)(3'-untranslatedregion,3'UTR)相結(jié)合,可引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻譯,屬于轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)[10-12]。miRNA廣泛參與機(jī)體多種細(xì)胞功能如增殖、分化、衰老、凋亡等的變化,引起機(jī)體多種生理和病理改變,并且與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13-14]。近年來,miRNA已成為疾病分子研究的熱點(diǎn)[15-16]。miR-503-5p是一種新發(fā)現(xiàn)的具有腫瘤抑制作用的miRNA,可顯著抑制乳腺癌、宮頸癌、非小細(xì)胞肺癌和結(jié)直腸癌等多種腫瘤的生長[17-20]。然而,miR-503-5p對(duì)膀胱癌細(xì)胞生長的影響未見報(bào)道。我們通過miRNA靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站TargetScan和microRNA.org,并參考文獻(xiàn)報(bào)道[20],確定E2F3基因?yàn)閙iR-503-5p的靶基因。E2F3基因?qū)儆谵D(zhuǎn)錄因子E2F家族,具有促進(jìn)細(xì)胞由G0/G1向S期轉(zhuǎn)換的作用,參與細(xì)胞周期的調(diào)控[21-23]。有研究表明,E2F3基因在膀胱癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)[24],通過干擾E2F3基因的表達(dá)抑制膀胱癌的發(fā)生發(fā)展具有重要的研究意義。本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-503-5p至膀胱癌細(xì)胞后,E2F3基因的表達(dá)水平顯著下調(diào),表明miR-503-5p可顯著抑制E2F3基因的表達(dá)。E2F3基因通過激活下游蛋白cyclinE的表達(dá),使得cyclinE-CDK2激酶復(fù)合物形成增加,導(dǎo)致
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