目的:非整倍體指細(xì)胞內(nèi)染色體數(shù)目出現(xiàn)異常,有絲分裂過(guò)程中紡錘體檢驗(yàn)點(diǎn)功能失調(diào)等都可導(dǎo)致非整倍體的產(chǎn)生。大多數(shù)腫瘤中都存在非整倍體現(xiàn)象。臨床上非整倍體程度高的腫瘤預(yù)后較差。研究表明非整倍體腫瘤細(xì)胞對(duì)常規(guī)化療藥物如順鉑、奧沙利鉑和羥基脲等具有耐藥性。因此,探討更多種類化療藥物對(duì)非整倍體腫瘤細(xì)胞的作用情況對(duì)臨床腫瘤治療具有重要的意義。哌立福新（Perifosine）是目前處于臨床試驗(yàn)階段的一種蛋白激酶B（Protein kinase B,PKB,通稱AKT）抑制劑,其可以通過(guò)抑制AKT活性增加抑癌基因p53的表達(dá),進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。哌立福新對(duì)不同核型腫瘤細(xì)胞的作用差異以及相關(guān)機(jī)制目前尚缺乏研究。本文以結(jié)腸癌為研究對(duì)象,通過(guò)在整倍體結(jié)腸癌細(xì)胞的基礎(chǔ)上構(gòu)建非整倍體模型,研究整倍體和非整倍體結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)哌立福新的耐藥性差異,并進(jìn)一步對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討。方法:（1）通過(guò)pT3G-MAD2慢病毒表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建HCT116-MAD2細(xì)胞系,該細(xì)胞系經(jīng)鹽酸強(qiáng)力霉素（Doxycycline,Dox）處理可以激活tet-on系統(tǒng)使細(xì)胞短時(shí)表達(dá)MAD2 shRNA以敲低紡錘體檢驗(yàn)點(diǎn)關(guān)鍵蛋白MAD2表達(dá),進(jìn)而... 

【文章來(lái)源】：揚(yáng)州大學(xué)江蘇省

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖３．１?Ｄｏｘ（－）和Ｄｏｘ（＋）細(xì)胞內(nèi)熒光觀察結(jié)果??Ｆｉｇｕｒｅ?３．１?Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ?ｏｆ?ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｉｎ?Ｄｏｘ（－）?ａｎｄ?Ｄｏｘ（＋）?ｃｅｌｌｓ??－

??（Ｃ?）?Ａｔ?Ｄａｙ?６，?Ｄｏｘ（－）?ｃｅｌｌｓ?ｓｈｏｗｅｄ?ｎｏ?ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，?ｗｈｉｌｅ?ｒｅｄ?ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｗａｓ?ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｉｎ?ｏｎｌｙ??ａ?ｆｅｗ?ｏｆ?Ｄｏｘ（＋）?ｃｅｌｌｓ．??２．?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ檢測(cè)ＭＡＤ２蛋白在Ｄｏｘ（－）和Ｄｏｘ（＋）細(xì)胞中表達(dá)水平??使用Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ檢測(cè)Ｄｏｘ處理ＨＣＴ１１６－ＭＡＤ２細(xì)胞后第３天和第６天Ｄｏｘ㈠??和Ｄｏｘ（＋）細(xì)胞中ＳＡＣ關(guān)鍵蛋白ＭＡＤ２的表達(dá)情況。如圖３．２所示，第３天Ｄｏｘ（＋）??細(xì)胞中ＭＡＤ２表達(dá)水平相對(duì)Ｄｏｘ（－）細(xì)胞顯著下降，第６天Ｄｏｘ（＋）細(xì)胞中ＭＡＤ２??表達(dá)與Ｄｏｘ（－）細(xì)胞相較基本恢復(fù)。??ＭＡＤ２??Ａ?６??１．Ｄ－??Ｄａｙ?３?Ｄａｙ?６?Ｊ?■?Ｄａｙ３??ｎ?￣?§?１．０－?＿?丁?■?Ｄａｙ６??Ｄ〇Ｘ?＂?，?苫?Ｉ??ＭＡＤ２?２７?ｋＤａ?Ｊ?〇?Ｈ???—ｉ?Ｉ?§?｜｜??�。眨拢眨蹋桑�?〇?〇?Ｉ?￥?￥?￥?￥??圖３．２?Ｄｏｘ（－）和Ｄｏｘ（＋）細(xì)胞中ＭＡＤ２蛋白的表達(dá)情況??Ｆｉｇｕｒｅ?３．２?Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＭＡＤ２?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｉｎ?Ｄｏｘ（－）?ａｎｄ?Ｄｏｘ（＋）?ｃｅｌｌｓ??（八）＼＼＾〖６１１１１３１〇〖結(jié)果圖。０〇＼處理后第３天，０〇＼（＋）組細(xì)胞＼／１八０２表達(dá)顯著低于０〇又（－）??細(xì)胞。第６天時(shí)，Ｄｏｘ（＋）細(xì)胞中ＭＡＤ２表達(dá)基本恢復(fù)正常。??（Ｂ）?Ａ圖條帶亮度分析結(jié)果。＊＊Ｐ＜０．０１??（Ａ）?Ｐｈｙｓｉｃａｌ?ｉｍａｇｅ?ｂｙ?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ．Ａ

耐藥性??１．通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)和ＣＣＫ－８實(shí)驗(yàn)檢測(cè)哌立福新處理后Ｄｏｘ（－）和Ｄｏｘ（＋）細(xì)胞的生長(zhǎng)??情況??為分析整倍體Ｄｏｘ（－）和非整倍體Ｄ〇Ｘ（＋）細(xì)胞對(duì)哌立福新的耐藥性差異，首??先檢測(cè)不同濃度哌立福新處理細(xì)胞４８?ｈ后兩組細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。脈立福新藥物??梯度設(shè)置如下：Ｏ｜ｉｍ〇ｌ／Ｌ、５ｊａｍｏｌ／Ｌ、ｌＯｊａｍｏｌ／Ｌ、２０（ｉｍｏｌ／Ｌ?和?４０ｊｉｍｏｌ／Ｌ。細(xì)胞??計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)表明，哌立福新處理４８?ｈ后非整倍體Ｄｏｘ（＋）細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目顯著高于??Ｄｏｘ（－）細(xì)胞（圖３．４），提示Ｄｏｘ（＋）細(xì)胞相較Ｄｏｘ（－）細(xì)胞對(duì)哌立福新具有耐藥性。??Ｓ?ｌ．〇．?Ｄｏｘ（＋）??｜?０．８?＋?Ｄｏｘ（－）??３?〇．６．?＼?卜又??Ｉ?０－４－?＼?、??０．２．??Ｐｅｒｉｆｏｓｉｎｅ?（｜ｉＭ）??圖３．４不同濃度哌立福新處理細(xì)胞４８?ｈ后Ｄｏｘ（－）和Ｄｏｘ（＋）組細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果??Ｆｉｇｕｒｅ?３．４?Ｃｅｌｌ?ｎｕｍｂｅｒｓ?ｏｆ?Ｄｏｘ（－）?ａｎｄ?Ｄｏｘ（＋）?ｃｅｌｌ?ａｆｔｅｒ?４８?ｈ?ｏｆ?ｐｅｒｉｆｏｓｉｎｅ?ｔｒｅａｔｍｅｎｔ??使用不同濃度哌立福新處理Ｄｏｘ（－）和Ｄｏｘ（＋）細(xì)胞４８ｈ。隨著哌立福新濃度的升高，兩組細(xì)??胞數(shù)量呈劑量依賴性降低，而Ｄｏｘ（＋）組細(xì)胞數(shù)量明顯多于Ｄｏｘ（－）組。＊＊Ｐ＜０．０１??Ｄｏｘ（－）?ａｎｄ?Ｄｏｘ（＋）?ｃｅｌｌｓ?ｗｅｒｅ?ｔｒｅａｔｅｄ?ｗｉｔｈ?ｐｅｒｉｆｏｓｉｎｅ?ａｔ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ?ｆｏｒ?４８?ｈ．?Ｗｉｔｈ?ｔｈｅ??ｉｎｃｒｅａｓｅ?ｏｆ?ｐｅｒｉｆｏｓｉｎｅ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔ


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