目的:非整倍體指細胞內(nèi)染色體數(shù)目出現(xiàn)異常,有絲分裂過程中紡錘體檢驗點功能失調(diào)等都可導致非整倍體的產(chǎn)生。大多數(shù)腫瘤中都存在非整倍體現(xiàn)象。臨床上非整倍體程度高的腫瘤預后較差。研究表明非整倍體腫瘤細胞對常規(guī)化療藥物如順鉑、奧沙利鉑和羥基脲等具有耐藥性。因此,探討更多種類化療藥物對非整倍體腫瘤細胞的作用情況對臨床腫瘤治療具有重要的意義。哌立福新（Perifosine）是目前處于臨床試驗階段的一種蛋白激酶B（Protein kinase B,PKB,通稱AKT）抑制劑,其可以通過抑制AKT活性增加抑癌基因p53的表達,進而抑制腫瘤細胞增殖。哌立福新對不同核型腫瘤細胞的作用差異以及相關(guān)機制目前尚缺乏研究。本文以結(jié)腸癌為研究對象,通過在整倍體結(jié)腸癌細胞的基礎(chǔ)上構(gòu)建非整倍體模型,研究整倍體和非整倍體結(jié)腸癌細胞對哌立福新的耐藥性差異,并進一步對其機制進行初步探討。方法:（1）通過pT3G-MAD2慢病毒表達質(zhì)粒構(gòu)建HCT116-MAD2細胞系,該細胞系經(jīng)鹽酸強力霉素（Doxycycline,Dox）處理可以激活tet-on系統(tǒng)使細胞短時表達MAD2 shRNA以敲低紡錘體檢驗點關(guān)鍵蛋白MAD2表達,進而... 

【文章來源】：揚州大學江蘇省

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖３．１?Ｄｏｘ（－）和Ｄｏｘ（＋）細胞內(nèi)熒光觀察結(jié)果??Ｆｉｇｕｒｅ?３．１?Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ?ｏｆ?ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｉｎ?Ｄｏｘ（－）?ａｎｄ?Ｄｏｘ（＋）?ｃｅｌｌｓ??－

??（Ｃ?）?Ａｔ?Ｄａｙ?６，?Ｄｏｘ（－）?ｃｅｌｌｓ?ｓｈｏｗｅｄ?ｎｏ?ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，?ｗｈｉｌｅ?ｒｅｄ?ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｗａｓ?ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｉｎ?ｏｎｌｙ??ａ?ｆｅｗ?ｏｆ?Ｄｏｘ（＋）?ｃｅｌｌｓ．??２．?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ檢測ＭＡＤ２蛋白在Ｄｏｘ（－）和Ｄｏｘ（＋）細胞中表達水平??使用Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ檢測Ｄｏｘ處理ＨＣＴ１１６－ＭＡＤ２細胞后第３天和第６天Ｄｏｘ㈠??和Ｄｏｘ（＋）細胞中ＳＡＣ關(guān)鍵蛋白ＭＡＤ２的表達情況。如圖３．２所示，第３天Ｄｏｘ（＋）??細胞中ＭＡＤ２表達水平相對Ｄｏｘ（－）細胞顯著下降，第６天Ｄｏｘ（＋）細胞中ＭＡＤ２??表達與Ｄｏｘ（－）細胞相較基本恢復。??ＭＡＤ２??Ａ?６??１．Ｄ－??Ｄａｙ?３?Ｄａｙ?６?Ｊ?■?Ｄａｙ３??ｎ?￣?§?１．０－?＿?丁?■?Ｄａｙ６??Ｄ〇Ｘ?＂?，?苫?Ｉ??ＭＡＤ２?２７?ｋＤａ?Ｊ?〇?Ｈ???—ｉ?Ｉ?§?｜｜??�。眨拢眨蹋桑�?〇?〇?Ｉ?￥?￥?￥?￥??圖３．２?Ｄｏｘ（－）和Ｄｏｘ（＋）細胞中ＭＡＤ２蛋白的表達情況??Ｆｉｇｕｒｅ?３．２?Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＭＡＤ２?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｉｎ?Ｄｏｘ（－）?ａｎｄ?Ｄｏｘ（＋）?ｃｅｌｌｓ??（八）＼＼＾〖６１１１１３１〇〖結(jié)果圖。０〇＼處理后第３天，０〇＼（＋）組細胞＼／１八０２表達顯著低于０〇又（－）??細胞。第６天時，Ｄｏｘ（＋）細胞中ＭＡＤ２表達基本恢復正常。??（Ｂ）?Ａ圖條帶亮度分析結(jié)果。＊＊Ｐ＜０．０１??（Ａ）?Ｐｈｙｓｉｃａｌ?ｉｍａｇｅ?ｂｙ?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ．Ａ

耐藥性??１．通過細胞計數(shù)和ＣＣＫ－８實驗檢測哌立福新處理后Ｄｏｘ（－）和Ｄｏｘ（＋）細胞的生長??情況??為分析整倍體Ｄｏｘ（－）和非整倍體Ｄ〇Ｘ（＋）細胞對哌立福新的耐藥性差異，首??先檢測不同濃度哌立福新處理細胞４８?ｈ后兩組細胞的生長情況。脈立福新藥物??梯度設(shè)置如下：Ｏ｜ｉｍ〇ｌ／Ｌ、５ｊａｍｏｌ／Ｌ、ｌＯｊａｍｏｌ／Ｌ、２０（ｉｍｏｌ／Ｌ?和?４０ｊｉｍｏｌ／Ｌ。細胞??計數(shù)實驗表明，哌立福新處理４８?ｈ后非整倍體Ｄｏｘ（＋）細胞的細胞數(shù)目顯著高于??Ｄｏｘ（－）細胞（圖３．４），提示Ｄｏｘ（＋）細胞相較Ｄｏｘ（－）細胞對哌立福新具有耐藥性。??Ｓ?ｌ．〇．?Ｄｏｘ（＋）??｜?０．８?＋?Ｄｏｘ（－）??３?〇．６．?＼?卜又??Ｉ?０－４－?＼?、??０．２．??Ｐｅｒｉｆｏｓｉｎｅ?（｜ｉＭ）??圖３．４不同濃度哌立福新處理細胞４８?ｈ后Ｄｏｘ（－）和Ｄｏｘ（＋）組細胞計數(shù)結(jié)果??Ｆｉｇｕｒｅ?３．４?Ｃｅｌｌ?ｎｕｍｂｅｒｓ?ｏｆ?Ｄｏｘ（－）?ａｎｄ?Ｄｏｘ（＋）?ｃｅｌｌ?ａｆｔｅｒ?４８?ｈ?ｏｆ?ｐｅｒｉｆｏｓｉｎｅ?ｔｒｅａｔｍｅｎｔ??使用不同濃度哌立福新處理Ｄｏｘ（－）和Ｄｏｘ（＋）細胞４８ｈ。隨著哌立福新濃度的升高，兩組細??胞數(shù)量呈劑量依賴性降低，而Ｄｏｘ（＋）組細胞數(shù)量明顯多于Ｄｏｘ（－）組。＊＊Ｐ＜０．０１??Ｄｏｘ（－）?ａｎｄ?Ｄｏｘ（＋）?ｃｅｌｌｓ?ｗｅｒｅ?ｔｒｅａｔｅｄ?ｗｉｔｈ?ｐｅｒｉｆｏｓｉｎｅ?ａｔ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ?ｆｏｒ?４８?ｈ．?Ｗｉｔｈ?ｔｈｅ??ｉｎｃｒｅａｓｅ?ｏｆ?ｐｅｒｉｆｏｓｉｎｅ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔ


本文編號：3404923