目的DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 1（DNA（cytosine-5）methyltransferase 1,DNMT1）是肺癌等惡性腫瘤的重要生物標(biāo)志之一。檢測其在生物樣本中的表達(dá)活性和水平對(duì)癌癥的早期診斷和預(yù)后有很重要的意義。本研究擬采用磁性納米顆粒作為固相載體,采用自組裝核酸探針信號(hào)放大技術(shù)建立檢測DNMT1表達(dá)活性和水平的新方法,為臨床樣本中DNMT1活性和水平的檢測提供新選擇,為腫瘤的早期診斷提供新思路。方法1.自組裝核酸探針信號(hào)放大技術(shù)檢測DNMT1活性方法的建立首先,利用鏈霉親和素和生物素的高親和力將生物素化的DNMT1作用序列（Biotin-S1’-S2’）固定到鏈霉親和素磁珠上。其次,利用自組裝的方法構(gòu)建熒光信號(hào)放大探針聚四甲基羅丹明（聚TAMRA）。之后,將構(gòu)建好的聚TAMRA通過DNA雜交作用連接到Biotin-S1’-S2’上,利用聚TAMRA上含有多個(gè)熒光染料TAMRA實(shí)現(xiàn)熒光檢測信號(hào)的放大。最后加入目標(biāo)物DNMT1和限制性內(nèi)切酶BssHⅡ。當(dāng)DNMT1存在時(shí),可將半甲基化的Biotin-S1’-S2’完全甲基化,使其不被BssHⅡ識(shí)別和切斷,熒光信號(hào)較強(qiáng);當(dāng)DNMT1不... 

【文章來源】：鄭州大學(xué)河南省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖２．１自組裝核酸探針信號(hào)放大技術(shù)檢測ＤＮＭＴ１活性的原理圖??（２）檢測ＤＮＭＴ１活性的技術(shù)路線??＇

圖２．３信號(hào)放大探針聚ＴＡＭＲＡ形成原理??

ＡＭ；復(fù)溶于雜交緩沖液中在熒光光譜儀上檢測體系的熒光強(qiáng)??度，根據(jù)熒光強(qiáng)度和ＤＮＭＴ１的濃度之間的線性關(guān)系，實(shí)現(xiàn)ＤＮＭＴ１表達(dá)水平的??定量檢測。??〇?〇??＿?Ｍ?Ｙ?ＡＡ?Ｙ?ｗｍ?ｘ．＞??Ａ—八—Ｍ?一汽一汽?＾??｜）１??＾＿＿＾?汽??ＷｋｖＨｅｎｉｔｔｌＭｎｍ）??Ｙ?ＭｃＡｂＤＮＭＴ１?Ｙ羊抗兔丨ｇＧ－Ｂｉｏ?■鏈霉親和素?羧基磁珠??：■＇?ＰｃＡｂＤＮＭＴ１?傷待測樣品中的ＤＮＭＴ１?／Ｍｗａ和ｗｓｏｃ＾＾ｑｉｗｗｖ?Ｂｉｏｔｉｎ－聚ＦＡＭ??圖２．４自組裝核酸探針信號(hào)放大技術(shù)檢測ＤＮＭＴ１水平的原理圖??（２）檢測ＤＮＭＴ１水平的技術(shù)路線??檢測ＤＮＭＴ１表達(dá)水平的技術(shù)路線如圖２．５所示。用ＥＤＣ／ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ活化法??將羧基磁珠和ＭｃＡｂＤＮＭＴｌ進(jìn)行偶聯(lián)，得到免疫磁珠，用于特異性捕獲ＤＮＭＴ１。??捕獲目標(biāo)物后的免疫磁珠再與ＰｃＡｂＤＮＭＴＫ羊抗兔ＩｇＧ－Ｂｉｏ結(jié)合構(gòu)成雙抗夾心免??疫磁珠。??將單鏈ＤＮＡ?Ｓ３－Ｂｉｏｔｉｎ和Ｓ４＇ＦＡＭ進(jìn)行雜交，得到長短不一的含有多個(gè)??ＦＡＭ的Ｂｉｏｔｉｎ－聚ＦＡＭ。用橋聯(lián)介質(zhì)鏈霉親和素將雙抗夾心免疫磁珠和聚ＦＡＭ??連接起來，通過檢測ＦＡＭ的熒光強(qiáng)度定量ＤＮＭＴ１的表達(dá)水平。用單因素實(shí)驗(yàn)??對(duì)檢測條件進(jìn)行優(yōu)化后，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)所建立方法的檢出限、精密度、加標(biāo)??回收率和特異性進(jìn)行考察。??１５??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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