目的DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 1（DNA（cytosine-5）methyltransferase 1,DNMT1）是肺癌等惡性腫瘤的重要生物標志之一。檢測其在生物樣本中的表達活性和水平對癌癥的早期診斷和預后有很重要的意義。本研究擬采用磁性納米顆粒作為固相載體,采用自組裝核酸探針信號放大技術(shù)建立檢測DNMT1表達活性和水平的新方法,為臨床樣本中DNMT1活性和水平的檢測提供新選擇,為腫瘤的早期診斷提供新思路。方法1.自組裝核酸探針信號放大技術(shù)檢測DNMT1活性方法的建立首先,利用鏈霉親和素和生物素的高親和力將生物素化的DNMT1作用序列（Biotin-S1’-S2’）固定到鏈霉親和素磁珠上。其次,利用自組裝的方法構(gòu)建熒光信號放大探針聚四甲基羅丹明（聚TAMRA）。之后,將構(gòu)建好的聚TAMRA通過DNA雜交作用連接到Biotin-S1’-S2’上,利用聚TAMRA上含有多個熒光染料TAMRA實現(xiàn)熒光檢測信號的放大。最后加入目標物DNMT1和限制性內(nèi)切酶BssHⅡ。當DNMT1存在時,可將半甲基化的Biotin-S1’-S2’完全甲基化,使其不被BssHⅡ識別和切斷,熒光信號較強;當DNMT1不... 

【文章來源】：鄭州大學河南省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２．１自組裝核酸探針信號放大技術(shù)檢測ＤＮＭＴ１活性的原理圖??（２）檢測ＤＮＭＴ１活性的技術(shù)路線??＇

圖２．３信號放大探針聚ＴＡＭＲＡ形成原理??

ＡＭ；復溶于雜交緩沖液中在熒光光譜儀上檢測體系的熒光強??度，根據(jù)熒光強度和ＤＮＭＴ１的濃度之間的線性關(guān)系，實現(xiàn)ＤＮＭＴ１表達水平的??定量檢測。??〇?〇??＿?Ｍ?Ｙ?ＡＡ?Ｙ?ｗｍ?ｘ．＞??Ａ—八—Ｍ?一汽一汽?＾??｜）１??＾＿＿＾?汽??ＷｋｖＨｅｎｉｔｔｌＭｎｍ）??Ｙ?ＭｃＡｂＤＮＭＴ１?Ｙ羊抗兔丨ｇＧ－Ｂｉｏ?■鏈霉親和素?羧基磁珠??：■＇?ＰｃＡｂＤＮＭＴ１?傷待測樣品中的ＤＮＭＴ１?／Ｍｗａ和ｗｓｏｃ＾＾ｑｉｗｗｖ?Ｂｉｏｔｉｎ－聚ＦＡＭ??圖２．４自組裝核酸探針信號放大技術(shù)檢測ＤＮＭＴ１水平的原理圖??（２）檢測ＤＮＭＴ１水平的技術(shù)路線??檢測ＤＮＭＴ１表達水平的技術(shù)路線如圖２．５所示。用ＥＤＣ／ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ活化法??將羧基磁珠和ＭｃＡｂＤＮＭＴｌ進行偶聯(lián)，得到免疫磁珠，用于特異性捕獲ＤＮＭＴ１。??捕獲目標物后的免疫磁珠再與ＰｃＡｂＤＮＭＴＫ羊抗兔ＩｇＧ－Ｂｉｏ結(jié)合構(gòu)成雙抗夾心免??疫磁珠。??將單鏈ＤＮＡ?Ｓ３－Ｂｉｏｔｉｎ和Ｓ４＇ＦＡＭ進行雜交，得到長短不一的含有多個??ＦＡＭ的Ｂｉｏｔｉｎ－聚ＦＡＭ。用橋聯(lián)介質(zhì)鏈霉親和素將雙抗夾心免疫磁珠和聚ＦＡＭ??連接起來，通過檢測ＦＡＭ的熒光強度定量ＤＮＭＴ１的表達水平。用單因素實驗??對檢測條件進行優(yōu)化后，建立標準曲線，對所建立方法的檢出限、精密度、加標??回收率和特異性進行考察。??１５??

【參考文獻】：
期刊論文
[1]DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1與維甲酸受體β在子宮頸癌變中的表達及相互關(guān)系[J]. 戰(zhàn)翠新.  中國藥物與臨床. 2019(16)
[2]Development of a rapid and sensitivity magnetic chemiluminescence immunoassay for DNA methyltransferase 1 in human serum[J]. Sitian He,Leiliang He,Beibei Liu,Songcheng Yu,Li’e Liu,Yongmei Tian,Jia Wang,Lihua Ding,Yilin Wang,Lingbo Qu,Fei Yu,Yongjun Wu.  Chinese Chemical Letters. 2019(05)
[3]DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在胃癌中的表達及其意義[J]. 王震凱,楊曉倩,葉雅沁,韋志琴,顧燕,范青青,劉丹,汪芳裕.  胃腸病學. 2019(02)
[4]DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與腫瘤關(guān)系的研究進展[J]. 肖梟,王艷林,黃利鳴.  生命科學. 2019(01)
[5]DNA甲基化的分子機制及其研究進展[J]. 宋喬,高世超,王培昌.  基因組學與應(yīng)用生物學. 2019(07)
[6]DNMT1在卵巢癌組織中的表達及其對卵巢癌細胞增殖和遷移的影響[J]. 李潔,郭艷平,武磊,劉艷麗,鄒余糧.  現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學. 2018(24)
[7]宮頸癌中DNMT1的高表達與其不良生存結(jié)局的相關(guān)性[J]. 羅舒,陳非,郭黔,文慶蓮.  實用醫(yī)學雜志. 2018(17)
[8]GLI1轉(zhuǎn)錄因子突變及異構(gòu)體在惡性腫瘤的研究進展[J]. 劉宇軒,劉陶文.  華夏醫(yī)學. 2018(02)
[9]人源DNMT1基因啟動子熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建及其活性檢測[J]. 黃滔,曹玉祥,張志堅,周興路,魏慧君,吳志浩.  皖南醫(yī)學院學報. 2018(01)
[10]宮頸病變組織中DNMT1和MeCP2異常表達與細胞生物學特征的相關(guān)性研究[J]. 林薇,馬莎.  海南醫(yī)學院學報. 2016(19)

碩士論文
[1]電致化學發(fā)光法檢測人類甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT1）活性的研究[D]. 郭智慧.南京師范大學 2017



本文編號：3362616