目的:結(jié)直腸癌是嚴(yán)重危害人類健康的消化道惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率都高居全世界惡性腫瘤的前三位。研究表明,DNA啟動(dòng)子異常甲基化導(dǎo)致的基因表達(dá)沉默及其功能改變與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展、免疫逃逸及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。課題組前期通過全基因組甲基化測序方法篩選出囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（Cystic fibrosis transmmembrane conductance regulator,CFTR）的特異性甲基化與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),本研究著眼探討其在結(jié)直腸原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中的甲基化水平及其功能。方法:（1）采用全基因組甲基化測序技術(shù)對山東大學(xué)附屬千佛山醫(yī)院病理科保存的12例結(jié)直腸原發(fā)癌組織及其對應(yīng)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織和正常腸黏膜組織（距原發(fā)癌邊緣>5cm）進(jìn)行測序,篩選結(jié)果中組間甲基化水平差異倍數(shù)Log2FC>|1|且P<0.05的甲基化差異基因;（2）收集70例結(jié)直腸癌石蠟組織樣本（包括12例測序所用樣本）利用甲基化特異性PCR（methylation-specific PCR,MSP）驗(yàn)證候選基因CFTR啟動(dòng)子甲基化狀態(tài),并分析其與臨床病理特征的關(guān)系;（3）運(yùn)用免... 

【文章來源】：山東大學(xué)山東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１：?ＭｅｔｈｙｌＲＡＤ全基因組甲基化測序?qū)嶒?yàn)原理示意圖??圖１Ａ：演示酶切及測序過程

??山東大學(xué)碩士學(xué)位論文???ＧＶ２４８??１｜?—??＼ＺＪ??圖２?ＣＦＴＲ過表達(dá)慢病毒圖譜??３．?７?ＭＴＴ增殖實(shí)驗(yàn)??（１）�。磯K９６孔板，分別標(biāo)記為０、２４、４８、７２ｈ。收集對數(shù)生長期ＨＣＴ１１６和??Ｃａｃｏ－２細(xì)胞系，�。保福埃穑碳�(xì)胞懸液于９６孔板中，每個(gè)孔中的細(xì)胞數(shù)約為６０００??個(gè)，每組中設(shè)置３個(gè)重復(fù)孔，并培養(yǎng)２４ｈ。同時(shí)設(shè)置相同處理?xiàng)l件的調(diào)零孔。??（２）每２４ｈ取出９６孔板，小心吸棄上清液，每孔加入９０汕完全培養(yǎng)基和１０ＭＬ?ＭＴＴ??溶液，繼續(xù)培養(yǎng)４ｈ。??（３）小心吸出每個(gè)孔內(nèi)的液體，加入ｌｌＯｐｉ?Ｆｏｒｍａｚａｎ溶解液，置于搖床上，低??速震蕩ｌＯｍｉｎ，充分溶解結(jié)晶物，使用酶標(biāo)儀測量并記錄各孔在４９０ｎｍ處的??吸光值。??（４）以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以所測得的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞增殖曲線。??３．?８克隆形成實(shí)驗(yàn)??（１）用０．２５％胰酶消化處于對數(shù)生長期的ＨＣＴ１１６、ＣａＣｏ－２，加入完全培養(yǎng)基，??用力吹打，使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞，梯度稀釋細(xì)胞懸液，并以適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃??度接種在６ｃｍ培養(yǎng)皿中，使得每個(gè)孔中的細(xì)胞數(shù)約為１０００個(gè)，接種完后，??輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使細(xì)胞分散均勻。??２４??

?山東大學(xué)碩Ｌ－學(xué)位論文???結(jié)果??１．?ＣＦＴＲ基因的篩選??利用ＭｅｔｈｙｌＲＡＤ全基因組甲基化測序技術(shù)對１２例結(jié)直腸癌樣本（即：原??發(fā)癌組織及其對應(yīng)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織和正常腸粘膜組織）進(jìn)行檢測，篩選測序??結(jié)果中組間差異Ｚ５值彡〇．〇５且Ｌｏｇ＿．ＦＣ＞ｌ的候選基因。結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織??及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中ＣＦＴＲ甲基化水ｆ均髙丁？正常腸黏膜組織（產(chǎn)〇．?００４，??Ｌｏｇ２ＦＣ＝４．４１３），見圖?３。??１０?０．?Ｉ?？??７?５?■?｜｜??ｏ＇?？丨：??Ｉ?：?：??〇?５?０－?．！?！?？?？?Ｒｅｇｕｌａｔｅ??■＊￣?？?｜?｜?？??〇?？?？?？?？?ｄｏｗｎ??丁?？?？?＊?？??參?？?？?Ｉ?Ｉ?？?？?ｎｏ?ｃｈａｎｇｅｄ??？?？，?１?？?ｕｐ??ｒ．?？：＊?；?－＊．?？?？??．？?？？？？?？：、“：?１，?＊＊?，?：?ＣＦＴ－Ｒ－?？??？?？？：?？?．＊：＇淡ａ??……??Ｏ?？??５?０?５??ｌｏｇ２（ＦＣ）??圖３甲基化差異基因ＣＦＴＲ的篩選??注：Ｌｏｇ」ＦＣ＞０代表在結(jié)直腸癌腫瘤組織中發(fā)生高甲基化，Ｌｏｇ：ＦＣ＜０代表在結(jié)直??腸癌腫瘤組織屮發(fā)生低甲基化。??２．?ＣＦＴＲ在人類結(jié)直腸癌中頻繁發(fā)生甲基化??選�。罚袄＝Y(jié)直腸黏膜組織及對應(yīng)的癌組織進(jìn)行ＭＳＰ實(shí)驗(yàn)，結(jié)汜品��？，??兩者中ＣＦＴＲ啟動(dòng)子甲基化率分別為４１．４％（２９／７０）和６２．２％（４５／７０），部分結(jié)果??２７??

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號：3292308