發(fā)布時(shí)間：2021-06-27 12:02

　　目的基于多價(jià)適配體構(gòu)建一種簡(jiǎn)單快速的腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)方法。方法通過滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)形成多價(jià)適配體的長鏈支架（含重復(fù)的Poly T）,與靶向核仁素的AS1411適配體熒光信號(hào)鏈（帶有Ploy A）雜交后,構(gòu)建多價(jià)適配體識(shí)別探針Multi-AS1411-LS,并對(duì)其進(jìn)行表征。用流式細(xì)胞和共聚焦顯微鏡分析Multi-AS1411-LS探針對(duì)腫瘤細(xì)胞識(shí)別的可行性,并進(jìn)一步對(duì)識(shí)別條件進(jìn)行了優(yōu)化,最后對(duì)臨床漿膜腔積液標(biāo)本中的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè),評(píng)價(jià)其特異性和敏感性。結(jié)果構(gòu)建的多價(jià)適配體識(shí)別探針在室溫下5 min即可識(shí)別腫瘤細(xì)胞,比單價(jià)的AS1411適配體識(shí)別腫瘤細(xì)胞的熒光強(qiáng)度高100倍左右,且最低檢測(cè)限為3個(gè)細(xì)胞。該多價(jià)適配體識(shí)別探針在臨床標(biāo)本腫瘤細(xì)胞檢測(cè)中,能很好地區(qū)分良惡性細(xì)胞,敏感度為87.80%,特異性為93.10%。結(jié)論基于滾環(huán)擴(kuò)增合成的多價(jià)適配體能快速檢測(cè)漿膜腔積液中腫瘤細(xì)胞,操作方法簡(jiǎn)單,有較好的特異性和敏感度。 

【文章來源】：第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào). 2020,42(23)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：9 頁

【部分圖文】：

基于滾環(huán)合成的多價(jià)適配體對(duì)腫瘤細(xì)胞快速 診斷的原理示意圖

為了證實(shí)環(huán)狀模板的成功制備以及滾環(huán)擴(kuò)增的DNA長鏈的合成,使用凝膠電泳對(duì)不同的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析。成環(huán)后的模板明顯要比預(yù)成環(huán)的單鏈遷移得慢且亮度更高,滾環(huán)產(chǎn)物滯留在加樣孔內(nèi),反應(yīng)時(shí)間為15 min后的產(chǎn)物條帶中不見多余的成環(huán)產(chǎn)物(圖2)。說明短時(shí)間內(nèi)即可獲得較大分子量的滾環(huán)產(chǎn)物。由于AS1411是富G序列,可形成G-四鏈體,硫黃素T(thioflavin T,ThT)是一種水溶性熒光染料,與G-四鏈體的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致可見光區(qū)的發(fā)射增強(qiáng),形成特征性的熒光光譜(圖3A)。在最大發(fā)射波長485 nm處,與ThT結(jié)合后,Multi-AS1411-LS探針較單價(jià)AS1411的熒光強(qiáng)度明顯升高(P<0.01,圖3B)。滾環(huán)產(chǎn)物經(jīng)過熱激活后熒光很弱(圖3C),表明滾環(huán)產(chǎn)物經(jīng)熱激活后沒有聚集現(xiàn)象的發(fā)生,而Multi-AS1411-LS與Evagreen結(jié)合后熒光強(qiáng)度很高,證實(shí)了其雜交的成功。Zeta電位檢測(cè)結(jié)果顯示,與單價(jià)Zeta電位相比,Multi-AS1411-LS的電荷明顯增多(P<0.01,圖3D)。這也可證實(shí)Multi-AS1411-LS的成功制備。

特異性檢測(cè)結(jié)果顯示,A549(人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞)、MDA-MB-231(人乳腺癌細(xì)胞)、NCI-H446(人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞)這3種腫瘤細(xì)胞株的熒光信號(hào)均大幅增強(qiáng),而BE-AS-2B(人正常肺支氣管上皮細(xì)胞)細(xì)胞株未被Multi-AS1411-LS探針識(shí)別,未觀察到熒光信號(hào),見圖6。圖4 流式細(xì)胞儀分析Multi-AS1411-LS探針與A549細(xì)胞結(jié)合情況


本文編號(hào)：3252810