目的本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)miR-146b能引起卵巢癌細(xì)胞骨架排列紊亂,抑制卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移。在此基礎(chǔ)上,本課題以miR-146b的靶基因?yàn)榍腥朦c(diǎn),從肌動(dòng)蛋白骨架和細(xì)胞間連接角度解析miR-146b引起卵巢上皮細(xì)胞癌（epithelial ovarian cancer,EOC）細(xì)胞形態(tài)改變,進(jìn)而抑制細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制。方法1.利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miR-146b的靶基因,將其中評(píng)分較高且與維持細(xì)胞形態(tài)密切相關(guān)的Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1）作為候選靶基因,采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證其與miR-146b的靶向關(guān)系。2.免疫印跡檢測(cè)瞬時(shí)或穩(wěn)定過表達(dá)miR-146b對(duì)Rac1蛋白表達(dá)水平的影響。3.構(gòu)建兩個(gè)pLKO.1-puro Rac1 shRNA慢病毒載體,分別包裝后感染卵巢癌細(xì)胞,免疫印跡驗(yàn)證Rac1敲減水平。4.倒置顯微鏡觀察穩(wěn)定敲減Rac1的卵巢癌細(xì)胞形態(tài),免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞肌動(dòng)蛋白和緊密連接蛋白1（zonula occludens-1,ZO-1）的表達(dá)水平,免疫熒光染色后采用共聚焦熒... 

【文章來源】：江蘇大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

miRNA的生物合成和效應(yīng)途徑[28]

miR-146b作用于Rac1調(diào)控人卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制研究16（14）15%分離膠：ddH2O500μL，30%丙烯酰胺2.5mL，1.5MTris-HCl（pH=8.8）1.9mL，10%SDS50μL，10%APS50μL，最后加TEMED2μL。（15）濃縮膠×2：ddH2O2.1mL、30%丙烯酰胺500μL、1.5MTris-HCl（pH=6.8）380μL、10%SDS30μL、10%APS30μL、最后加TEMED3μL，3.1.5質(zhì)粒圖譜圖3.1psiCHECKTM-2質(zhì)粒圖譜[76]Figure3.1PlasmidmapofpsiCHECKTM-2[76]3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)HEK-293T、SKOV3和HO8910均采用含10%FBS和100U/ml青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，置5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)、傳代。3.2.1.1細(xì)胞傳代取出生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，移液槍貼壁棄去廢舊的培養(yǎng)基，用37℃PBS洗滌細(xì)胞兩次。均勻滴加剛好能鋪滿培養(yǎng)皿底部的胰酶，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞變圓時(shí)立刻加入等體積的培養(yǎng)基終止消化。用移液槍將貼壁的細(xì)胞吹打并轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，800rpm離心5min。棄去上清，用1mL培養(yǎng)基重懸，在培養(yǎng)皿中加入3-4mL培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需求吸取合適的細(xì)胞懸液傳代。3.2.1.2細(xì)胞凍存將細(xì)胞匯合度約90%的細(xì)胞同3.2.1.1操作得細(xì)胞沉淀，用500μL培養(yǎng)基重懸。按照DMEM:FBS:DMSO=8:9:3的比例制備凍存液，和細(xì)胞懸液等比例混合后轉(zhuǎn)移至凍存管，梯度凍存4℃30min、-20℃120min，最后于-80℃短期保存或液氮長期保存。3.2.2Rac13’UTR熒光報(bào)告基因載體的構(gòu)建

江蘇大學(xué)碩士學(xué)位論文253.3.1生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-146b的靶基因用三種生物信息學(xué)軟件miRanda、miRDB、miRWalk綜合預(yù)測(cè)出miR-146b可能的靶基因，從中挑選出與細(xì)胞骨架、腫瘤轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為高度相關(guān)的基因Rac1，針對(duì)其種子序列設(shè)計(jì)突變序列，見圖3.2。圖3.2miR-146b與Rac1的結(jié)合分析及針對(duì)種子序列（下劃線）設(shè)計(jì)的突變序列Figure3.2BioinformaticpredictionofRac1astargetofmiR-146bandputativeseed-pairregionwasinred3.3.2雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-146b靶向Rac1雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)是確定miRNA靶基因的金標(biāo)準(zhǔn)[77]，為了驗(yàn)證Rac1是miR-146b的靶基因，我們將進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，并采用已報(bào)道的miR-146b的靶基因Fbxl10作為陽性參照。3.3.2.1Rac13’UTR熒光報(bào)告基因載體及其突變體的鑒定為了滿足雙熒光素酶報(bào)告基因的實(shí)驗(yàn)需求，本研究構(gòu)建了兩個(gè)報(bào)告基因質(zhì)粒，一個(gè)是在psiCHECKTM-2載體中插入Rac13’-UTR全長序列（1521bp），命名為psiCHECK2-Rac1-3’UTR，另一個(gè)是采用重疊PCR法將Rac13’-UTR中與miR-146b結(jié)合的種子序列突變后插入psiCHECK2載體中得到的psiCHECK2-Rac1-3’mut載體。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，五個(gè)psiCHECK2-Rac1-3’UTR載體的樣本經(jīng)PCR擴(kuò)增后可于1521bp處發(fā)現(xiàn)條帶，psiCHECK2-Rac1-3’mut載體經(jīng)PCR擴(kuò)增后僅樣本7、9、11于1521bp處可見條帶，見圖3.3。選取PCR鑒定成功的樣本1和7送至公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果證實(shí)插入psiCHECKTM-2載體的序列與Rac1-3’UTR或Rac1-3’mut片段一致，說明兩個(gè)載體psiCHECK2-Rac1-3’UTR和psiCHECK2-Rac1-3’mut均構(gòu)建成功。

【參考文獻(xiàn)】：
博士論文
[1]miR-146b在卵巢上皮細(xì)胞癌中的作用及機(jī)制研究[D]. 閆美娜.江蘇大學(xué) 2018



本文編號(hào)：3233861