目的:本研究擬構(gòu)建食管鱗癌EC109細(xì)胞耐藥亞系,通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討Ouabain通過(guò)抑制Wnt/β-catenin的入核實(shí)現(xiàn)對(duì)食管癌耐藥株EC109/CDDP細(xì)胞CDDP耐藥性的影響,期望為今后食管癌順鉑耐藥逆轉(zhuǎn)的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)、開(kāi)辟新的思路。方法:1、通過(guò)順鉑間歇給藥誘導(dǎo)的方法構(gòu)建對(duì)順鉑耐藥的人食管鱗癌細(xì)胞株采用中等劑量順鉑間歇給藥方式對(duì)EC109細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo),建立起對(duì)順鉑耐藥的人食管鱗癌細(xì)胞株。在順鉑存在的情況下,用MTT法檢測(cè)EC109細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率,計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）;通過(guò)Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)法檢測(cè)兩種細(xì)胞的凋亡率;CCK-8法測(cè)定EC109和EC109/CDDP細(xì)胞對(duì)CDDP的耐藥性;通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)方法（Fluorescence Activted cell sorter,FACS）檢測(cè)兩種細(xì)胞的細(xì)胞周期分布情況;Transwell檢測(cè)這兩種細(xì)胞在順鉑作用后的侵襲能力。2、Ouabain通過(guò)抑制Wnt/β-catenin的入核實(shí)現(xiàn)對(duì)食管癌EC109/CDDP細(xì)胞的影響通過(guò)MTT法檢測(cè)Ouabain、CDDP及Ouabain聯(lián)合CDDP對(duì)EC10... 

【文章來(lái)源】：蘇州大學(xué)江蘇省

【文章頁(yè)數(shù)】：85 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

-gp的結(jié)構(gòu)圖Fig1StructurediagramofP-glycoprotein

圖2經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路和非經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路Fig 2 Classical Wnt signaling pathway and non classical Wnt signaling pathway要[42]。在經(jīng)典 Wnt 信號(hào)通路中，受到這種信號(hào)刺激后，相應(yīng)的 Wnt 蛋zzled 與 LRP5/6 受體結(jié)合而開(kāi)啟此這種信號(hào)通路，并活化胞質(zhì)內(nèi) Dsh 蛋活化狀態(tài)后可以抑制由 APC 蛋白、GSK- 3β、形成的 GSK-3β 的活性，鏈蛋白的磷酸化，這樣泛素蛋白酶體就不能識(shí)別且降解此種蛋白，進(jìn)而積聚。當(dāng) β-catenin 大量積累后就進(jìn)入到胞核，并和其中的 TCF/LEFs 游靶基因的啟動(dòng)子暴露出來(lái)而被激活表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖。Wnt 信下，細(xì)胞質(zhì)中的 β-catenin 與 APC、Axin、GSK-3β、酪蛋白激酶（Casein起形成多蛋白復(fù)合物；當(dāng) GSK-3β 磷酸化 β-catenin 的 Ser33、Ser37 和CK 磷酸化 β-catenin 的 ser45 殘基后，泛素化依賴(lài)的 β-TrCP 蛋白會(huì)活化解，減少進(jìn)入核內(nèi)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子的 β-catenin 的水平，形成細(xì)胞的正常調(diào)nin 和這種通路的作用發(fā)揮存在密切的關(guān)系，是整條通路的關(guān)鍵樞紐分子

1.1順鉑耐藥細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果每次加入順鉑四十八小時(shí)內(nèi)，顯微鏡觀(guān)察 EC109 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞處于靜止生長(zhǎng)狀態(tài)。棄去含有順鉑培養(yǎng)基，并用預(yù)熱 PBS 洗滌，加入正常無(wú)藥培養(yǎng)液，細(xì)胞的形態(tài)出現(xiàn)了明顯的變化，變鈍變圓，體積也明顯的縮小，且從瓶壁脫落，最終大部分的細(xì)胞脫落下來(lái)，小部分呈現(xiàn)集落。大部分的細(xì)胞是對(duì)順鉑耐藥程度較差的細(xì)胞，而占比例大約 5 %左右的小部分細(xì)胞，就是培養(yǎng)的耐藥細(xì)胞。七天后細(xì)胞又逐漸恢復(fù)生長(zhǎng)接著進(jìn)行同樣劑量順鉑沖擊后，繼續(xù)上述過(guò)程，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)變化程度沒(méi)有之前明顯存活的剩下的細(xì)胞比例不斷在增加。顯微鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有出現(xiàn)明顯的變化，但核稍變大，核/漿比例有一定的提高，且出現(xiàn)了很少的多角形細(xì)胞（Fig 3）。采用相同條件的藥物沖擊處理數(shù)月，最終得到可對(duì) 0.5 μg/ml 順鉑含藥培養(yǎng)液耐藥的可傳代的人 ESCC 耐藥細(xì)胞株，其耐藥能力與野生型細(xì)胞相比差異極顯著。復(fù)蘇生長(zhǎng)后，速度和野生型細(xì)胞接近。

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