目的目前關(guān)于HBeAg的研究多集中在臨床分析,對(duì)肝癌細(xì)胞及其微環(huán)境的影響及作用機(jī)制的研究較少,我們利用慢病毒載體技術(shù)構(gòu)建HBeAg基因穩(wěn)定表達(dá)的Hep G2肝癌細(xì)胞株,鑒定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中HBeAg的表達(dá),研究HBeAg的表達(dá)對(duì)Hep G2細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響。方法參照GenBank中人HBeAg基因序列化學(xué)合成目的基因片段,構(gòu)建攜帶HBe Ag基因序列的慢病毒載體,依靠慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將HBeAg基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入Hep G2細(xì)胞基因組,通過(guò)嘌呤霉素篩選和單克隆培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,使用RT-qPCR、Western blot技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞HBeAg的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平,IFMA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中HBeAg的表達(dá)。CCK-8實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn),Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的變化。并于傳代培養(yǎng)3個(gè)月后檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株HBeAg mRNA和蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞生物學(xué)特性有無(wú)明顯變化。結(jié)果成功構(gòu)建攜帶HBeAg基因序列的慢病毒載體,慢病毒產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中HBe Ag序列對(duì)比同源性為100%。使用慢病毒轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞,經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得轉(zhuǎn)染H... 

【文章來(lái)源】：廣西醫(yī)科大學(xué)廣西壯族自治區(qū)

【文章頁(yè)數(shù)】：78 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

慢病毒載體結(jié)構(gòu)示意圖

28圖 1-2 慢病毒產(chǎn)物測(cè)序后對(duì)比結(jié)果Fig. 1-2 Lentivirus product sequencing comparison results同的 MOI 值轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光表達(dá)情況病毒轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞置于熒光顯微鏡 100 倍視野下觀察，熒光內(nèi)綠色熒光，如圖 1-3（圖 A、B、C、D、E、F 轉(zhuǎn)染細(xì)胞所值分別為 3、6、9、12、15、18），隨著 MOI 值增大熒光細(xì)胞

29圖 1-3 不同 MOI 值條件下慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光成像效果。(所有圖片均為顯微鏡 100 倍視野A、B、C、D、E、F 對(duì)應(yīng)的 MOI 值分別為 3、6、9、12、15、18。Fig. 1-3 Fluorescence images of lentivirus transfected cells under different MOI values. (×100)esponding MOI values for A, B, C, D, E, and F are 3, 6, 9, 12, 15, 18, respectively. 單克隆培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞嘌呤霉素篩選 1 周后進(jìn)行單克隆培養(yǎng)，10d 后單細(xì)胞克隆形

【參考文獻(xiàn)】：
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