目的:探究由CBP、NOX2、Ku70及Mre11組成的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)控人類黑素瘤細(xì)胞凋亡、副凋亡及壞死的機制,為發(fā)現(xiàn)聯(lián)合調(diào)控ROS及DNA損傷修復(fù)機制治療惡性黑色素瘤的siRNA靶向藥物,和CBP缺失所致疾病的分子機制提供一定的研究基礎(chǔ)。方法:1.分別設(shè)計合成Mre11、Ku70的特異性的siRNA各3對,采用脂質(zhì)體高效轉(zhuǎn)染試劑Expect2000將siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入黑色素瘤A375細(xì)胞。2.RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染24 h后CBP、Ku70和Mre11的mRNA水平。選用70%敲低效率作為CBP siRNA和Ku70 siRNA、CBP siRNA和Mre11 siRNA單轉(zhuǎn)染及共轉(zhuǎn)染的劑量。3.CCK-8和流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染24 h后對A375細(xì)胞增殖、死亡的影響。4.連續(xù)跟蹤轉(zhuǎn)染siRNA后A375細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化,流式細(xì)胞術(shù)轉(zhuǎn)染24 h后檢測ROS水平。5.RT-qPCR及Western Blot檢測轉(zhuǎn)染24 h后A375細(xì)胞NOX2的表達(dá)。6.DAPI染色連續(xù)跟蹤轉(zhuǎn)染24 h后A375細(xì)胞核的變化。7.RT-qPCR及Western Blot檢測轉(zhuǎn)染24 h后A375細(xì)胞... 

【文章來源】：河北大學(xué)河北省

【文章頁數(shù)】：93 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 研究問題的提出
    1.2 研究目的及意義
    1.3 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀
        1.3.1 乙酰轉(zhuǎn)移酶-CBP
        1.3.2 DNA損傷修復(fù)因子-Ku70
        1.3.3 DNA損傷修復(fù)因子-Mre11
    1.4 研究思路與方法
        1.4.1 研究思路與方法
        1.4.2 研究方法
    1.5 研究內(nèi)容
    1.6 創(chuàng)新點
第二章 由CBP、Ku70、NOX2 組成的基因調(diào)控網(wǎng)調(diào)節(jié)黑素瘤細(xì)胞凋亡、副凋亡及壞死
    2.1 前言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 實驗材料
        2.2.2 實驗試劑
        2.2.3 實驗儀器
    2.3 實驗方法
        2.3.1 A375 細(xì)胞的復(fù)蘇與凍存
        2.3.2 繪制黑色瘤細(xì)胞生長曲線
        2.3.3 特異性siRNA序列的設(shè)計與合成
        2.3.4 siRNA的配制與轉(zhuǎn)染
        2.3.5 實時熒光定量PCR檢測基因的表達(dá)
        2.3.6 Western Blot檢測目的蛋白的表達(dá)
        2.3.7 CCK-8 檢測細(xì)胞增殖
        2.3.8 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡
        2.3.9 流式細(xì)胞儀檢測ROS
        2.3.10 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期
        2.3.11 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
        2.3.12 DAPI染色觀察細(xì)胞核
        2.3.13 統(tǒng)計學(xué)分析
    2.4 實驗結(jié)果
        2.4.1 敲低CBP和/或Ku70 后抑制A375 細(xì)胞的增殖
        2.4.2 敲低CBP和/或Ku70后A375 細(xì)胞出現(xiàn)不同方式的死亡
        2.4.3 敲低CBP和/或Ku70后A375 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化
        2.4.4 敲低CBP和/或Ku70后A375 細(xì)胞的ROS變化
        2.4.5 敲低CBP和/或Ku70 后增加A375 細(xì)胞中NOX2 的表達(dá)
        2.4.6 敲低CBP和/或Ku70 后誘導(dǎo)A375 細(xì)胞核降解
        2.4.7 敲低A375 細(xì)胞中CBP后通過降低Ku70 的表達(dá)誘導(dǎo)凋亡
        2.4.8 敲低CBP和/或Ku70 后誘導(dǎo)A375 細(xì)胞S期阻滯
    2.5 討論
第三章 CBP和 Mre11 對人惡性黑色素瘤細(xì)胞發(fā)展的影響
    3.1 前言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 實驗材料
        3.2.2 實驗儀器
    3.3 實驗方法
        3.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇與凍存
        3.3.2 特異性siRNA序列的設(shè)計與合成
        3.3.3 siRNA的配制與轉(zhuǎn)染
        3.3.4 實時熒光定量PCR檢測目的基因的表達(dá)
        3.3.5 CCK-8 檢測細(xì)胞增殖
        3.3.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞死亡
        3.3.7 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期
        3.3.8 DAPI染色觀察細(xì)胞核
        3.3.9 流式細(xì)胞儀檢測ROS
        3.3.10 統(tǒng)計學(xué)分析
    3.4 實驗結(jié)果
        3.4.1 敲低CBP和/或Mre11 后抑制細(xì)胞增殖
        3.4.2 敲低CBP和/或Mre11 后對A375 細(xì)胞死亡的影響
        3.4.3 敲低CBP和/或Mre11 后對A375 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響
        3.4.4 敲低CBP和/或Mre11 后對A375 細(xì)胞的ROS變化
        3.4.5 敲低CBP和/或Mre11 后誘導(dǎo)A375 細(xì)胞核降解
        3.4.6 敲低CBP和/或Mre11 后對A375 細(xì)胞周期的影響
    3.5 討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀碩士期間取得的學(xué)術(shù)成果


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]退火解旋酶SMARCAL1在維持基因組穩(wěn)定中的作用與機制[J]. 文雅蕾,呂柯孬,徐小康,張欣,丁良,潘學(xué)峰.  遺傳. 2019(12)
[2]CBP基因與腫瘤相關(guān)性研究進(jìn)展[J]. 李桂香,李致玲,周棟.  醫(yī)學(xué)綜述. 2015(14)

碩士論文
[1]內(nèi)源性ROS自穩(wěn)態(tài)失衡對黑色素瘤細(xì)胞殺滅作用的研究[D]. 張欣.河北大學(xué) 2019



本文編號：3170337