目的:探究由CBP、NOX2、Ku70及Mre11組成的基因轉錄調控網(wǎng)絡調控人類黑素瘤細胞凋亡、副凋亡及壞死的機制,為發(fā)現(xiàn)聯(lián)合調控ROS及DNA損傷修復機制治療惡性黑色素瘤的siRNA靶向藥物,和CBP缺失所致疾病的分子機制提供一定的研究基礎。方法:1.分別設計合成Mre11、Ku70的特異性的siRNA各3對,采用脂質體高效轉染試劑Expect2000將siRNA轉染進入黑色素瘤A375細胞。2.RT-qPCR檢測轉染24 h后CBP、Ku70和Mre11的mRNA水平。選用70%敲低效率作為CBP siRNA和Ku70 siRNA、CBP siRNA和Mre11 siRNA單轉染及共轉染的劑量。3.CCK-8和流式細胞術檢測轉染24 h后對A375細胞增殖、死亡的影響。4.連續(xù)跟蹤轉染siRNA后A375細胞形態(tài)學的變化,流式細胞術轉染24 h后檢測ROS水平。5.RT-qPCR及Western Blot檢測轉染24 h后A375細胞NOX2的表達。6.DAPI染色連續(xù)跟蹤轉染24 h后A375細胞核的變化。7.RT-qPCR及Western Blot檢測轉染24 h后A375細胞... 

【文章來源】：河北大學河北省

【文章頁數(shù)】：93 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 研究問題的提出
    1.2 研究目的及意義
    1.3 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀
        1.3.1 乙酰轉移酶-CBP
        1.3.2 DNA損傷修復因子-Ku70
        1.3.3 DNA損傷修復因子-Mre11
    1.4 研究思路與方法
        1.4.1 研究思路與方法
        1.4.2 研究方法
    1.5 研究內(nèi)容
    1.6 創(chuàng)新點
第二章 由CBP、Ku70、NOX2 組成的基因調控網(wǎng)調節(jié)黑素瘤細胞凋亡、副凋亡及壞死
    2.1 前言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 實驗材料
        2.2.2 實驗試劑
        2.2.3 實驗儀器
    2.3 實驗方法
        2.3.1 A375 細胞的復蘇與凍存
        2.3.2 繪制黑色瘤細胞生長曲線
        2.3.3 特異性siRNA序列的設計與合成
        2.3.4 siRNA的配制與轉染
        2.3.5 實時熒光定量PCR檢測基因的表達
        2.3.6 Western Blot檢測目的蛋白的表達
        2.3.7 CCK-8 檢測細胞增殖
        2.3.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡
        2.3.9 流式細胞儀檢測ROS
        2.3.10 流式細胞儀檢測細胞周期
        2.3.11 細胞形態(tài)學觀察
        2.3.12 DAPI染色觀察細胞核
        2.3.13 統(tǒng)計學分析
    2.4 實驗結果
        2.4.1 敲低CBP和/或Ku70 后抑制A375 細胞的增殖
        2.4.2 敲低CBP和/或Ku70后A375 細胞出現(xiàn)不同方式的死亡
        2.4.3 敲低CBP和/或Ku70后A375 細胞的形態(tài)學變化
        2.4.4 敲低CBP和/或Ku70后A375 細胞的ROS變化
        2.4.5 敲低CBP和/或Ku70 后增加A375 細胞中NOX2 的表達
        2.4.6 敲低CBP和/或Ku70 后誘導A375 細胞核降解
        2.4.7 敲低A375 細胞中CBP后通過降低Ku70 的表達誘導凋亡
        2.4.8 敲低CBP和/或Ku70 后誘導A375 細胞S期阻滯
    2.5 討論
第三章 CBP和 Mre11 對人惡性黑色素瘤細胞發(fā)展的影響
    3.1 前言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 實驗材料
        3.2.2 實驗儀器
    3.3 實驗方法
        3.3.1 細胞復蘇與凍存
        3.3.2 特異性siRNA序列的設計與合成
        3.3.3 siRNA的配制與轉染
        3.3.4 實時熒光定量PCR檢測目的基因的表達
        3.3.5 CCK-8 檢測細胞增殖
        3.3.6 流式細胞儀檢測細胞死亡
        3.3.7 流式細胞儀檢測細胞周期
        3.3.8 DAPI染色觀察細胞核
        3.3.9 流式細胞儀檢測ROS
        3.3.10 統(tǒng)計學分析
    3.4 實驗結果
        3.4.1 敲低CBP和/或Mre11 后抑制細胞增殖
        3.4.2 敲低CBP和/或Mre11 后對A375 細胞死亡的影響
        3.4.3 敲低CBP和/或Mre11 后對A375 細胞形態(tài)學的影響
        3.4.4 敲低CBP和/或Mre11 后對A375 細胞的ROS變化
        3.4.5 敲低CBP和/或Mre11 后誘導A375 細胞核降解
        3.4.6 敲低CBP和/或Mre11 后對A375 細胞周期的影響
    3.5 討論
結論
參考文獻
致謝
攻讀碩士期間取得的學術成果


【參考文獻】：
期刊論文
[1]退火解旋酶SMARCAL1在維持基因組穩(wěn)定中的作用與機制[J]. 文雅蕾,呂柯孬,徐小康,張欣,丁良,潘學峰.  遺傳. 2019(12)
[2]CBP基因與腫瘤相關性研究進展[J]. 李桂香,李致玲,周棟.  醫(yī)學綜述. 2015(14)

碩士論文
[1]內(nèi)源性ROS自穩(wěn)態(tài)失衡對黑色素瘤細胞殺滅作用的研究[D]. 張欣.河北大學 2019



本文編號：3170337