全球范圍內(nèi),原發(fā)性肝癌是發(fā)生率第六、致死率第四的惡性腫瘤,且其發(fā)生率還在持續(xù)上升。乙型肝炎、丙型肝炎感染,肝硬化,過量飲酒和攝入黃曲霉毒素是導致原發(fā)性肝癌的公認危險因素。中國是肝癌高發(fā)地區(qū),根據(jù)流行病學研究統(tǒng)計,僅2015年,全國新發(fā)肝癌病例就達到了46萬例。目前,肝癌切除術(shù)仍是肝癌治療的首選方法。但由于早期肝癌癥狀不明確、生長特性隱匿,多數(shù)患者被確診時已處于疾病的中、晚期,可選擇的治療手段有限且效果甚微。研究顯示,肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多因素的復雜過程,受遺傳學和表觀遺傳學改變的累積驅(qū)動。但是,人們對肝癌發(fā)生的具體分子機制仍知之甚少。因此,探索肝癌的發(fā)生機制,明確肝癌發(fā)生過程中的關(guān)鍵分子事件,對于肝癌的早期診斷和有效治療至關(guān)重要。病理學和分子生物學研究顯示,胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生具相似性,共享許多關(guān)鍵信號通路和調(diào)控因子。癌胚分子就是指這一類在胚胎發(fā)育早期和腫瘤發(fā)生過程中高表達,而在成年階段低表達,甚至不表達的分子。這種在腫瘤中重新激活的特殊表達模式,表明癌胚分子可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。在肝癌研究中,甲胎蛋白（AFP）是最早被報道的癌胚分子,目前已經(jīng)作為血清檢測標志物... 

【文章來源】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學上海市 211工程院校

【文章頁數(shù)】：98 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

胎肝與成肝組織中差異lncRNA和m RNA聚類分析

以上研究結(jié)果提示我們,MIR4435-2HG是一個在胎肝和肝癌中高表達的癌胚分子,其表達水平的異常增高提示肝癌患者的不良預(yù)后,這意味著MIR4435-2HG可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。(三)肝癌細胞中l(wèi)ncRNA MIR4435-2HG的表達受m6A修飾調(diào)控

接下來,我們探討了MIR4435-2HG在肝癌中被重新激活的原因。研究顯示,lncRNA的表達受多種表觀遺傳學修飾調(diào)控,包括乙酰化、甲基化和mi RNA等。其中,m6A修飾是RNA中最常見的表觀遺傳修飾元件,且m6A修飾與胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生等生理、病理過程密切相關(guān)�？紤]到MIR4435-2HG發(fā)育階段表達特異性,以及腫瘤中異常激活,我們推測m6A修飾可能參與了MIR4435-2HG的表達調(diào)控。為了驗證這一猜想,首先,我們在SRAMP網(wǎng)站(http://www.cuilab.cn/sramp/)對MIR4435-2HG基因中可能的m6A修飾位點進行了預(yù)測,結(jié)果顯示,MIR4435-2HG存在多個潛在的m6A修飾位點,其中,第524位A堿基(GGACT)和第773位A堿基(GGACT)是最保守的m6A修飾模塊(圖1-3A)。為了驗證這一預(yù)測結(jié)果,我們進行了抗m6A抗體免疫共沉淀實驗。Real-time PCR結(jié)果顯示,HepG2和Huh7細胞中MIR4435-2HG片段在抗m6A抗體特異性結(jié)合的RNA沉淀中富集,MIR4435-2HG中確實存在m6A修飾(圖1-3B)。接下來,我們進一步探討m6A修飾是否參與了肝癌細胞中MIR4435-2HG的表達調(diào)控。體內(nèi)m6A修飾的動態(tài)變化主要依賴兩類酶:RNA甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3和METTL14,RNA去甲基化酶ALKBH5和FTO。已有研究顯示,重要的RNA甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3在肝癌組織中表達異常上升,并能夠促進肝癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[28];同時,GEO數(shù)據(jù)庫中GSE13149樣本數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明,METTL3在小鼠肝臟發(fā)育早期表達較高,而在發(fā)育過程中表達逐漸下調(diào)(圖1-4A),Western Blot結(jié)果同樣表明,胚胎期12.5天的小鼠肝臟組織中METTL3的表達高于8周齡成年小鼠肝組織中METTL3的表達(圖1-4B)。由于METTL3在胎肝與肝癌中的表達模式與MIR4435-2HG表達模式一致,我們推測METTL3可能通過m6A修飾參與了MIR4435-2HG的表達調(diào)控。為了驗證這一猜想,我們設(shè)計了針對METTL3的si RNA,同時在人肝癌細胞HepG2和Huh7中干擾METTL3表達(圖1-4C)。Real-time PCR結(jié)果顯示,干擾METTL3將顯著降低肝癌細胞中MIR4435-2HG的表達(圖1-4D)。同時,在肝癌患者隊列中隨機檢測40例患者肝癌組織中METTL3的表達水平,Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,METTL3在肝癌組織中的表達與MIR4435-2HG的表達呈正相關(guān)(圖1-4E)。上述研究結(jié)果表明,在肝癌細胞中RNA甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3參與了MIR4435-2HG異常激活的調(diào)控。


本文編號：3127099