全球范圍內(nèi),原發(fā)性肝癌是發(fā)生率第六、致死率第四的惡性腫瘤,且其發(fā)生率還在持續(xù)上升。乙型肝炎、丙型肝炎感染,肝硬化,過(guò)量飲酒和攝入黃曲霉毒素是導(dǎo)致原發(fā)性肝癌的公認(rèn)危險(xiǎn)因素。中國(guó)是肝癌高發(fā)地區(qū),根據(jù)流行病學(xué)研究統(tǒng)計(jì),僅2015年,全國(guó)新發(fā)肝癌病例就達(dá)到了46萬(wàn)例。目前,肝癌切除術(shù)仍是肝癌治療的首選方法。但由于早期肝癌癥狀不明確、生長(zhǎng)特性隱匿,多數(shù)患者被確診時(shí)已處于疾病的中、晚期,可選擇的治療手段有限且效果甚微。研究顯示,肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟、多因素的復(fù)雜過(guò)程,受遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變的累積驅(qū)動(dòng)。但是,人們對(duì)肝癌發(fā)生的具體分子機(jī)制仍知之甚少。因此,探索肝癌的發(fā)生機(jī)制,明確肝癌發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵分子事件,對(duì)于肝癌的早期診斷和有效治療至關(guān)重要。病理學(xué)和分子生物學(xué)研究顯示,胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生具相似性,共享許多關(guān)鍵信號(hào)通路和調(diào)控因子。癌胚分子就是指這一類(lèi)在胚胎發(fā)育早期和腫瘤發(fā)生過(guò)程中高表達(dá),而在成年階段低表達(dá),甚至不表達(dá)的分子。這種在腫瘤中重新激活的特殊表達(dá)模式,表明癌胚分子可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在肝癌研究中,甲胎蛋白（AFP）是最早被報(bào)道的癌胚分子,目前已經(jīng)作為血清檢測(cè)標(biāo)志物... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)上海市 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：98 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

胎肝與成肝組織中差異lncRNA和m RNA聚類(lèi)分析

以上研究結(jié)果提示我們,MIR4435-2HG是一個(gè)在胎肝和肝癌中高表達(dá)的癌胚分子,其表達(dá)水平的異常增高提示肝癌患者的不良預(yù)后,這意味著MIR4435-2HG可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。(三)肝癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MIR4435-2HG的表達(dá)受m6A修飾調(diào)控

接下來(lái),我們探討了MIR4435-2HG在肝癌中被重新激活的原因。研究顯示,lncRNA的表達(dá)受多種表觀遺傳學(xué)修飾調(diào)控,包括乙酰化、甲基化和mi RNA等。其中,m6A修飾是RNA中最常見(jiàn)的表觀遺傳修飾元件,且m6A修飾與胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生等生理、病理過(guò)程密切相關(guān)。考慮到MIR4435-2HG發(fā)育階段表達(dá)特異性,以及腫瘤中異常激活,我們推測(cè)m6A修飾可能參與了MIR4435-2HG的表達(dá)調(diào)控。為了驗(yàn)證這一猜想,首先,我們?cè)赟RAMP網(wǎng)站(http://www.cuilab.cn/sramp/)對(duì)MIR4435-2HG基因中可能的m6A修飾位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè),結(jié)果顯示,MIR4435-2HG存在多個(gè)潛在的m6A修飾位點(diǎn),其中,第524位A堿基(GGACT)和第773位A堿基(GGACT)是最保守的m6A修飾模塊(圖1-3A)。為了驗(yàn)證這一預(yù)測(cè)結(jié)果,我們進(jìn)行了抗m6A抗體免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。Real-time PCR結(jié)果顯示,HepG2和Huh7細(xì)胞中MIR4435-2HG片段在抗m6A抗體特異性結(jié)合的RNA沉淀中富集,MIR4435-2HG中確實(shí)存在m6A修飾(圖1-3B)。接下來(lái),我們進(jìn)一步探討m6A修飾是否參與了肝癌細(xì)胞中MIR4435-2HG的表達(dá)調(diào)控。體內(nèi)m6A修飾的動(dòng)態(tài)變化主要依賴(lài)兩類(lèi)酶:RNA甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3和METTL14,RNA去甲基化酶ALKBH5和FTO。已有研究顯示,重要的RNA甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3在肝癌組織中表達(dá)異常上升,并能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[28];同時(shí),GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中GSE13149樣本數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明,METTL3在小鼠肝臟發(fā)育早期表達(dá)較高,而在發(fā)育過(guò)程中表達(dá)逐漸下調(diào)(圖1-4A),Western Blot結(jié)果同樣表明,胚胎期12.5天的小鼠肝臟組織中METTL3的表達(dá)高于8周齡成年小鼠肝組織中METTL3的表達(dá)(圖1-4B)。由于METTL3在胎肝與肝癌中的表達(dá)模式與MIR4435-2HG表達(dá)模式一致,我們推測(cè)METTL3可能通過(guò)m6A修飾參與了MIR4435-2HG的表達(dá)調(diào)控。為了驗(yàn)證這一猜想,我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)METTL3的si RNA,同時(shí)在人肝癌細(xì)胞HepG2和Huh7中干擾METTL3表達(dá)(圖1-4C)。Real-time PCR結(jié)果顯示,干擾METTL3將顯著降低肝癌細(xì)胞中MIR4435-2HG的表達(dá)(圖1-4D)。同時(shí),在肝癌患者隊(duì)列中隨機(jī)檢測(cè)40例患者肝癌組織中METTL3的表達(dá)水平,Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,METTL3在肝癌組織中的表達(dá)與MIR4435-2HG的表達(dá)呈正相關(guān)(圖1-4E)。上述研究結(jié)果表明,在肝癌細(xì)胞中RNA甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3參與了MIR4435-2HG異常激活的調(diào)控。


本文編號(hào)：3127099