1.目的利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除4T1細胞中的整合素αavβ3基因,構建穩(wěn)定敲除整合素cxvβ3基因的4T1細胞株;分析阻斷骨唾液酸蛋白（BSP）與整合素的結合后乳腺癌細胞增殖、遷移和粘附能力的變化,檢測細胞內(nèi)PI3K、AKT、ERK、NF-κB p65和IκBa表達水平和其磷酸化水平的變化,進而探討阻斷整合素表達抑制乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的作用。2.方法（1）根據(jù)CRISPR/Cas9靶點設計原則,分別在整合素αv和β3亞基基因的外顯子區(qū)域設計2條sgRNA,構建lentiCRISPRv2-sgRNA重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)Stbl3,篩選出重組質(zhì)粒進測序驗證后轉(zhuǎn)染至HEK293Ft細胞包裝成慢病毒。（2）慢病毒感染4T1細胞后用嘌呤霉素加壓篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞,用有限稀釋法分離培養(yǎng)單克隆細胞。（3）提取單克隆細胞基因組DNA后對敲除位點附近的DNA片段進行PCR擴增并測序,用qRT-PCR檢測穩(wěn)定敲除細胞株整合素αv和β3亞基mRNA的表達,Western blot檢測細胞株整合素αvβ3蛋白質(zhì)的表達。（4）用CCK-8檢測小鼠乳腺癌4T1細胞增殖活性,用劃痕實驗和transwell檢測... 

【文章來源】：南方醫(yī)科大學廣東省

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１?ｌｅｎｔｉＣＲ丨ＳＰＲｖ２質(zhì)粒結構??

Ｆｉｇｕｒｅ?１?－４?Ｔｈｅ?ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?Ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｐＥＧＦＰ?ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ?２９３Ｆｔ?ｃｅｌｌｓ?（１?ＯＯｘ）??３．４確定嘌呤霉素篩選細胞的濃度??不同濃度嘌呤霉素作用于正常４Ｔ１細胞后各時間點細胞的狀態(tài)如圖１－５所??示，從圖中可看出，ｌＵｇ／ｍｌ的嘌呤霉素對４Ｔ１細胞基本沒有殺傷作用；２ｐｇ／ｍｌ??的嘌呤霉素對４Ｔ１細胞有一定的殺傷作用；３ｐｇ／ｍｌ的嘌呤霉素對４Ｔ１細胞的殺??傷作用明顯，作用４８ｈ后鏡下只見少數(shù)的細胞存活，７２ｈ則在鏡下只見極少數(shù)幾??個細胞存活；４ｎｇ／ｍ丨的嘌呤霉素作用４８ｈ后鏡下只見極少數(shù)兒個存活細胞，而??１９??

??３．３細胞轉(zhuǎn)染包裝慢病毒結果??質(zhì)粒轉(zhuǎn)染２９３Ｆｔ細胞后的效果情況如圖丨－４所示，從圖１￣４陽性對照質(zhì)粒??ｐＥＧＦＰ轉(zhuǎn)染２９３Ｆｔ細胞后產(chǎn)生綠色熒光的情況可知此次轉(zhuǎn)染包裝慢病毒效果可??行，提示包裝出的慢病毒可用于感染目的細胞。??ｗｍｍ?ｍ??■ｈ?ｍ??１２ｈ?２４ｈ??圖１￣４陽性對照質(zhì)粒ｐＥＧＦＰ轉(zhuǎn)染２９３Ｆｔ細胞后效果情況（ｌＯＯｘ）??Ｆｉｇｕｒｅ?１?－４?Ｔｈｅ?ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?Ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｐＥＧＦＰ?ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ?２９３Ｆｔ?ｃｅｌｌｓ?（１?ＯＯｘ）??３．４確定嘌呤霉素篩選細胞的濃度??不同濃度嘌呤霉素作用于正常４Ｔ１細胞后各時間點細胞的狀態(tài)如圖１－５所??示，從圖中可看出，ｌＵｇ／ｍｌ的嘌呤霉素對４Ｔ１細胞基本沒有殺傷作用；２ｐｇ／ｍｌ??的嘌呤霉素對４Ｔ１細胞有一定的殺傷作用；３ｐｇ／ｍｌ的嘌呤霉素對４Ｔ１細胞的殺??傷作用明顯，作用４８ｈ后鏡下只見少數(shù)的細胞存活，７２ｈ則在鏡下只見極少數(shù)幾??個細胞存活；４ｎｇ／ｍ丨的嘌呤霉素作用４８ｈ后鏡下只見極少數(shù)兒個存活細胞，而??１９??


本文編號：3122934