背景胰腺癌是惡性程度極高的惡性腫瘤之一,近年來雖然手術(shù)切除率和根治率有所提升,但5年生存率仍在8%左右。胰腺癌的免疫微環(huán)境以免疫抑制性T細(xì)胞聚集為特征,多種途徑誘導(dǎo)的免疫逃逸是胰腺癌極早期即可發(fā)生淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要原因,因此預(yù)后極差。外泌體是直徑50-150 nm的細(xì)胞外囊泡,作為一種細(xì)胞間通訊載體,通過抑制免疫應(yīng)答及誘導(dǎo)免疫抑制性分子的方式參與免疫調(diào)節(jié)。然而,胰腺癌來源的外泌體通過何種途徑誘導(dǎo)免疫抑制性T細(xì)胞來介導(dǎo)免疫逃逸,具體機(jī)制尚未完全闡明。目的本研究旨在探索胰腺癌來源的外泌體對T細(xì)胞基因表達(dá)、免疫表型及免疫功能的影響,為闡明胰腺癌的免疫逃逸機(jī)理及探索精準(zhǔn)免疫治療提供理論依據(jù)。方法采用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離純化外周血T淋巴細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng);采用超速離心法提取胰腺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的外泌體,并使用電子顯微鏡、粒徑分析及分子標(biāo)記物Western Blot檢測對提取的外泌體進(jìn)行純度鑒定;將提純的胰腺癌細(xì)胞來源外泌體用于刺激體外培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞。使用CD63-td Tomato標(biāo)記外泌體并用于刺激體外培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞,使用共聚焦顯微鏡追蹤T淋巴細(xì)胞對外泌體的攝取情況。通過... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：147 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

BxPC-3外泌體鑒定。A:電鏡觀察外泌體,外泌體為黑色箭頭所指;B:外泌體粒徑分析及電位檢測;C:Western Blot檢測外泌體標(biāo)志蛋白。

CD63是胰腺癌來源外泌體的標(biāo)記物,我們用融合了熒光蛋白tdTomato的CD63過表達(dá)慢病毒來感染Bx PC-3,構(gòu)建tdTomato-BxPC-3穩(wěn)轉(zhuǎn)株(圖2A)。從tdTomato-BxPC-3培養(yǎng)上清液中分離出攜帶熒光的tdTomato-exosomes,可用于外泌體示蹤。共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞本身不攜帶tdTomato熒光,tdTomato-exosomes刺激的T細(xì)胞攜帶tdTomato熒光(圖2B),說明人外周血T細(xì)胞攝取胰腺癌來源的外泌體。1.3.3外泌體抑制T細(xì)胞殺腫瘤細(xì)胞效應(yīng)

T細(xì)胞通過細(xì)胞毒活性殺傷腫瘤細(xì)胞,殺腫瘤效應(yīng)是T細(xì)胞在腫瘤免疫中的重要功能。我們將Ctrl-T或Exo-T作為殺傷細(xì)胞,Bx PC-3或PANC-1作為靶細(xì)胞,兩者在體外共培養(yǎng)48h,通過檢測靶細(xì)胞生長狀態(tài)來反應(yīng)T細(xì)胞的殺腫瘤效應(yīng)。單獨(dú)培養(yǎng)的胰腺癌細(xì)胞作為內(nèi)參,其生長狀態(tài)最好,與Exo-T共培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞的生長狀態(tài)次之,與Ctrl-T共培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞的生長狀態(tài)最差(圖3A)。這些結(jié)果說明,與Ctrl-T相比,Exo-T的殺腫瘤效應(yīng)顯著減弱。1.3.4外泌體誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫抑制性表型

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Complex role for the immune system in initiation and progression of pancreatic cancer[J]. Kristin S Inman,Amanda A Francis,Nicole R Murray.  World Journal of Gastroenterology. 2014(32)
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本文編號：3101528