目的:結(jié)直腸惡性腫瘤是臨床診療中最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,近年來(lái)在全世界范圍內(nèi)的發(fā)病率和死亡率均有明顯上升趨勢(shì),雖然現(xiàn)代診療技術(shù)發(fā)展迅猛,但總體療效依然有限。現(xiàn)已證明RAS信號(hào)通路激活與惡性腫瘤的發(fā)病、進(jìn)展和惡性程度密切相關(guān),K-Ras突變型結(jié)直腸癌患者的后續(xù)治療效果及預(yù)后明顯差于K-Ras野生型患者。有研究證明IκBα（即NFKBIA）異常積聚細(xì)胞核內(nèi)對(duì)K-Ras突變型腫瘤細(xì)胞有抑制作用。本課題利用基因拼接、DNA重組技術(shù)及重組蛋白表達(dá)技術(shù),重頭設(shè)計(jì)序列、構(gòu)建轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、生產(chǎn)純化重組蛋白CPP2-DN-NFKBIA-NLS,并研究目的重組蛋白在結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的轉(zhuǎn)入情況及其對(duì)抗腫瘤作用如對(duì)細(xì)胞增殖能力、遷移能力、凋亡情況等的影響。方法:1、通過(guò)相關(guān)網(wǎng)站查詢目的基因序列情況及相關(guān)資料,設(shè)計(jì)并優(yōu)化重組蛋白CPP2-DN-NFKBIA-NLS基因序列,基因合成后通過(guò)載體pET28b（+）質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到大腸桿菌BL21（DE3）及大腸桿菌C41感受態(tài)細(xì)菌中并通過(guò)抗生素篩選獲得陽(yáng)性目標(biāo)大表達(dá)菌株。培養(yǎng)陽(yáng)性菌株后利用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)陽(yáng)性菌株表達(dá)并分泌重組蛋白CPP2... 

【文章來(lái)源】：南方醫(yī)科大學(xué)廣東省

【文章頁(yè)數(shù)】：62 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖２－１相關(guān)氨基酸序列及重組蛋白簡(jiǎn)圖??－

?第二章重組蛋白的制備???Ｆｉｇｕｒｅ２－２?Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ＣＰＰ２－ＤＮ－ＮＦＫＢＩＡ－ＮＬＳ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｔｅｓｔ．?ＭＷ：?Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ??ｍａｒｋｅｒ．?０：?Ｎｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ?ｂａｃｔｅｒｉａ?ｃｕｌｔｕｒｅ?（ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ）．?Ｓｔｒａｉｎ?Ｎｏ．ｌ：?ＢＬ２１（ＤＥ３）．??Ｓｔｒａｉｎ?Ｎｏ．３：?Ｃ４１．??

?碩士學(xué)位論文???ＭＷ?２ｕｇ??１３８??６０??４５??３５??２５?－ｗ＃??２０??１５??１０??ＣＰＰ２－ＮＦＫＢＩＡ－ＮＬＳ??圖２－４重組蛋白ＣＰＰ２－ＤＮ－ＮＦＫＢＩＡ－ＮＬＳ最終樣品檢測(cè)??Ｆｉｇｕｒｅ２－４?Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ＣＰＰ２－ＤＮ－ＮＦＫＢＩＡ－ＮＬＳ?ｆｉｎａｌ?ｓａｍｐｌｅ?ＱＣ??２．３．２重組質(zhì)粒ｐＥＴ２８Ａ（＋）－ＤＮ－ＮＦＫＢＩＡ－ＮＬＳ轉(zhuǎn)化及蛋白表達(dá)情況??將重組□的質(zhì)粒ｐＥＴ２８Ａ（＋）－ｒＤＮ－ＮＦＫＢＩＡ－ＮＬＳ分別轉(zhuǎn)化至兩種大腸桿菌培??養(yǎng)體系屮：大腸桿菌ＢＬ２１（ＤＦ３）感受態(tài)細(xì)胞及大腸桿菌Ｃ４１感受態(tài)細(xì)胞后，按??操作分別擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行抗性篩選可見(jiàn)平板ｈ均長(zhǎng)出多個(gè)卩丨丨性克降菌落，提示??目的重組質(zhì)粒己成功轉(zhuǎn)化至目標(biāo)大腸桿菌培養(yǎng)體系中并通過(guò)抗性篩選形成單克??隆菌落，獲得了包含目的基因的陽(yáng)性克隆表達(dá)菌株，隨后可以進(jìn)一步分析表達(dá)??產(chǎn)物進(jìn)行陽(yáng)性克隆菌株的驗(yàn)證。挑選陽(yáng)性克隆菌株按照上述操作培養(yǎng)后提取??ＮＰＣ和ＤＰＥ進(jìn)行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，表達(dá)情況如下圖２－５所示：大腸桿菌ＢＬ２１（ＤＥ３）??感受態(tài)細(xì)胞及大腸桿菌Ｃ’４ｌ感受態(tài)細(xì)胞中．克降菌株均能成功衣達(dá)出口的蚩白，??并且目的重組蛋白在上清與蛋白沉淀屮均冇表達(dá)。??２．３．３重組目的蛋白ＣＰＰ２－ＤＮ－ＮＦＫＢＩＡ－ＮＬＳ的純化流程與產(chǎn)物鑒定??將收集到的包含ＣＰＰ２－ＤＮ－ＮＦＫＢＩＡ－ＮＬＳ的細(xì)胞裂解液通過(guò)Ｎｉ－柱純化，反復(fù)??洗脫、濃縮后貯存，純化過(guò)程情況見(jiàn)圖２－３。為確定ＣＰＰ２－ＤＮ－ＮＦＫＢＩＡ－ＮＬＳ在??大腸桿菌內(nèi)是否正確表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)？步用特異性６

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Identification and characterization of a novel bipartite nuclear localization signal in the hepatitis B virus polymerase[J]. Joachim Lupberger,Stephanie Schaedler,Alexander Peiran,Eberhard Hildt.  World Journal of Gastroenterology. 2013(44)



本文編號(hào)：3099870