目的探討自噬在A549/DDP細(xì)胞順鉑耐藥中的作用及機制。方法采用MTS法檢測A549/DDP細(xì)胞及其親本A549細(xì)胞對DDP耐藥性,計算A549/DDP細(xì)胞順鉑耐藥指數(shù)。通過Western blot、激光共聚焦和透射電子顯微鏡等方法檢測A549/DDP細(xì)胞及其親本A549細(xì)胞的自噬活性。使用DDP處理A549/DDP細(xì)胞,Western blot和RT-qPCR檢測DDP對自噬相關(guān)蛋白和基因表達的影響,初步探討其潛在的機制。構(gòu)建自噬關(guān)鍵基因敲低的A549/DDP細(xì)胞模型,采用MTS法驗證自噬對DDP耐藥性的影響。結(jié)果A549/DDP細(xì)胞對A549細(xì)胞順鉑耐藥指數(shù)為6.22,為中等耐藥細(xì)胞株。A549/DDP細(xì)胞中LC3B、ATG5、Beclin1和ATG7等自噬關(guān)鍵蛋白表達水平明顯高于A549細(xì)胞。使用DDP處理A549/DDP細(xì)胞后,LC3B、ATG5、Beclin1和ATG7等自噬關(guān)鍵蛋白表達水平下降,ATG5、Beclin1和ATG7的m RNA表達水平也顯著下降（p<0.05）,且呈現(xiàn)出時間依賴性和劑量依賴性。DDP可通過下調(diào)AMPKα和MiTF表達水平（p<0.... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

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【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

1DDP對A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞增殖的影響

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文182.1.2A549/DDP細(xì)胞自噬活性表達高于其親本A549細(xì)胞我們通過多種方法檢測A549細(xì)胞與A549/DDP細(xì)胞自噬活性。Westernblot結(jié)果顯示，與A549細(xì)胞相比，A549/DDP細(xì)胞具有較高的LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值（自噬活性標(biāo)記），而p62/SQSTM1的表達則較低（自噬基質(zhì)），表明A549/DDP具有更高的自噬活性，并且自噬通量很流暢（圖2.1B）。免疫熒光分析顯示，與A549細(xì)胞相比，A549/DDP細(xì)胞具有更高的LC3B表達量（圖2.1C），同時透射電子顯微鏡（TEM）的結(jié)果也表明，與A549細(xì)胞相比，A549/DDP細(xì)胞具有更多的自噬泡（圖2.1D）。最后，我們檢測了幾種關(guān)鍵的自噬相關(guān)蛋白的表達水平。Westernblot結(jié)果顯示，A549/DDP細(xì)胞中Beclin-1，ATG5和ATG7的表達水平高于A549細(xì)胞。通過上述數(shù)據(jù)可以表明A549/DDP細(xì)胞的自噬活性高于其親本A549細(xì)胞。圖2.1.2Westernblot檢測自噬關(guān)鍵蛋白在A549和A549/DDP細(xì)胞中的表達B.Westernblot測定A549和A549/DDP細(xì)胞中LC3B和p62的表達水平；C.A549和A549/DDP細(xì)胞中LC3B斑點（紅色信號）的免疫熒光分析，DAPI（藍色信號）用于染核,比例尺，20μm；D.TEM用于觀察A549和A549/DDP細(xì)胞中的自噬泡,下圖是放大圖像。紅色箭頭表示自噬泡。比例尺（上圖）為2μm，比例尺（下圖）為1μm；E.Westernblot測定A549和A549/DDP細(xì)胞中Beclin-1，ATG5和ATG7的表達水平。GAPDH用作上樣對照并

活性的潛在基因，我們使用RT-qPCR法檢測了主要自噬基因的mRNA表達，包括ULK1，ATG3，ATG4B，ATG4D，ATG5，BECN1，ATG7，ATG10，ATG12，ATG13，ATG14和ATG16L1。同樣采用不同時間點和藥物劑量來處理A549/DDP細(xì)胞。我們的結(jié)果表明，30μMDDP處理A549/DDP細(xì)胞后，在時間點組ATG5、BECN1、ATG7和ATG10的mRNA表達水平以時間依賴性方式顯著降低（圖2.3A）；同時，在藥物劑量組ATG5，BECN1，ATG7和ATG10的mRNA表達水平以劑量依賴性顯著降低（圖2.3B）。這些結(jié)果表明DDP處理可通過抑制幾個關(guān)鍵自噬基因的mRNA表達來抑制自噬活性。圖2.3DDP處理降低A549/DDP細(xì)胞關(guān)鍵自噬基因的表達A.QPCR檢測30μMDDP處理A549/DDP細(xì)胞0h，6h，12h后，自噬關(guān)鍵基因的表達。（p<0.05）；

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3095475