目的探討自噬在A549/DDP細(xì)胞順鉑耐藥中的作用及機(jī)制。方法采用MTS法檢測(cè)A549/DDP細(xì)胞及其親本A549細(xì)胞對(duì)DDP耐藥性,計(jì)算A549/DDP細(xì)胞順鉑耐藥指數(shù)。通過(guò)Western blot、激光共聚焦和透射電子顯微鏡等方法檢測(cè)A549/DDP細(xì)胞及其親本A549細(xì)胞的自噬活性。使用DDP處理A549/DDP細(xì)胞,Western blot和RT-qPCR檢測(cè)DDP對(duì)自噬相關(guān)蛋白和基因表達(dá)的影響,初步探討其潛在的機(jī)制。構(gòu)建自噬關(guān)鍵基因敲低的A549/DDP細(xì)胞模型,采用MTS法驗(yàn)證自噬對(duì)DDP耐藥性的影響。結(jié)果A549/DDP細(xì)胞對(duì)A549細(xì)胞順鉑耐藥指數(shù)為6.22,為中等耐藥細(xì)胞株。A549/DDP細(xì)胞中LC3B、ATG5、Beclin1和ATG7等自噬關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平明顯高于A549細(xì)胞。使用DDP處理A549/DDP細(xì)胞后,LC3B、ATG5、Beclin1和ATG7等自噬關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平下降,ATG5、Beclin1和ATG7的m RNA表達(dá)水平也顯著下降（p<0.05）,且呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性和劑量依賴性。DDP可通過(guò)下調(diào)AMPKα和MiTF表達(dá)水平（p<0.... 

【文章來(lái)源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

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1DDP對(duì)A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞增殖的影響

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文182.1.2A549/DDP細(xì)胞自噬活性表達(dá)高于其親本A549細(xì)胞我們通過(guò)多種方法檢測(cè)A549細(xì)胞與A549/DDP細(xì)胞自噬活性。Westernblot結(jié)果顯示，與A549細(xì)胞相比，A549/DDP細(xì)胞具有較高的LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值（自噬活性標(biāo)記），而p62/SQSTM1的表達(dá)則較低（自噬基質(zhì)），表明A549/DDP具有更高的自噬活性，并且自噬通量很流暢（圖2.1B）。免疫熒光分析顯示，與A549細(xì)胞相比，A549/DDP細(xì)胞具有更高的LC3B表達(dá)量（圖2.1C），同時(shí)透射電子顯微鏡（TEM）的結(jié)果也表明，與A549細(xì)胞相比，A549/DDP細(xì)胞具有更多的自噬泡（圖2.1D）。最后，我們檢測(cè)了幾種關(guān)鍵的自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。Westernblot結(jié)果顯示，A549/DDP細(xì)胞中Beclin-1，ATG5和ATG7的表達(dá)水平高于A549細(xì)胞。通過(guò)上述數(shù)據(jù)可以表明A549/DDP細(xì)胞的自噬活性高于其親本A549細(xì)胞。圖2.1.2Westernblot檢測(cè)自噬關(guān)鍵蛋白在A549和A549/DDP細(xì)胞中的表達(dá)B.Westernblot測(cè)定A549和A549/DDP細(xì)胞中LC3B和p62的表達(dá)水平；C.A549和A549/DDP細(xì)胞中LC3B斑點(diǎn)（紅色信號(hào)）的免疫熒光分析，DAPI（藍(lán)色信號(hào)）用于染核,比例尺，20μm；D.TEM用于觀察A549和A549/DDP細(xì)胞中的自噬泡,下圖是放大圖像。紅色箭頭表示自噬泡。比例尺（上圖）為2μm，比例尺（下圖）為1μm；E.Westernblot測(cè)定A549和A549/DDP細(xì)胞中Beclin-1，ATG5和ATG7的表達(dá)水平。GAPDH用作上樣對(duì)照并

活性的潛在基因，我們使用RT-qPCR法檢測(cè)了主要自噬基因的mRNA表達(dá)，包括ULK1，ATG3，ATG4B，ATG4D，ATG5，BECN1，ATG7，ATG10，ATG12，ATG13，ATG14和ATG16L1。同樣采用不同時(shí)間點(diǎn)和藥物劑量來(lái)處理A549/DDP細(xì)胞。我們的結(jié)果表明，30μMDDP處理A549/DDP細(xì)胞后，在時(shí)間點(diǎn)組ATG5、BECN1、ATG7和ATG10的mRNA表達(dá)水平以時(shí)間依賴性方式顯著降低（圖2.3A）；同時(shí)，在藥物劑量組ATG5，BECN1，ATG7和ATG10的mRNA表達(dá)水平以劑量依賴性顯著降低（圖2.3B）。這些結(jié)果表明DDP處理可通過(guò)抑制幾個(gè)關(guān)鍵自噬基因的mRNA表達(dá)來(lái)抑制自噬活性。圖2.3DDP處理降低A549/DDP細(xì)胞關(guān)鍵自噬基因的表達(dá)A.QPCR檢測(cè)30μMDDP處理A549/DDP細(xì)胞0h，6h，12h后，自噬關(guān)鍵基因的表達(dá)。（p<0.05）；

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]2015年中國(guó)惡性腫瘤流行情況分析[J]. 鄭榮壽,孫可欣,張思維,曾紅梅,鄒小農(nóng),陳茹,顧秀瑛,魏文強(qiáng),赫捷.  中華腫瘤雜志. 2019 (01)
[2]Autophagy and multidrug resistance in cancer[J]. Ying-Jie Li,Yu-He Lei,Nan Yao,Chen-Ran Wang,Nan Hu,Wen-Cai Ye,Dong-Mei Zhang,Zhe-Sheng Chen.  Chinese Journal of Cancer. 2017(08)



本文編號(hào)：3095475