發(fā)布時間：2021-03-18 18:38

　　PTEN是一個常見的腫瘤抑制因子,其磷酸酶活性能夠?qū)IP3進行去磷酸化以抑制AKT的活性。PTEN-Long（PTEN-L）是PTEN的一個亞型,國內(nèi)外多數(shù)文獻報道其N端173個氨基酸（PTEN-L leader）具有潛在的分泌信號。與經(jīng)典的PTEN不同的是,PTEN-L不僅能夠從細(xì)胞中分泌出來,還能再次進入其它細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮PTEN蛋白的生物學(xué)活性。該特點可以應(yīng)用于蛋白治療臨床疾病以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的DNA或者RNA載體運輸外源性基因進行基因治療。在該研究中,我們將PTEN-L leader與另一個腫瘤抑制因子TP53嵌合,經(jīng)過轉(zhuǎn)錄翻譯后形成融合蛋白PTEN-L-p53。我們在已過表達PTEN-L-p53的HEK293T細(xì)胞的培養(yǎng)基中檢測到該融合蛋白的存在,因此,PTEN-L-p53能夠像PTEN-L一樣從細(xì)胞內(nèi)分泌出來。利用PTEN-L-p53的分泌性,我們采用超濾管對含有融合蛋白的培養(yǎng)基進行超濾濃縮（CFPCM）,然后把CFPCM加入U251細(xì)胞(TP53^R273H,p53突變)中,進而顯著地抑制了該細(xì)胞的活性。由于PTEN-L-p53基因中包含的PTEN-L lea... 

【文章來源】：河南大學(xué)河南省

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

融合PTEN-Lleader與TP53獲得PTEN-L-p53

圖 4.2 構(gòu)建 pSecTag2 A-PTEN-L-p53 質(zhì)粒。（A）酶切鑒定 pSecTag2 A- PTEN-L-p53 質(zhì)粒，在 1800 bp 附近出現(xiàn) PTEN-L-P53 條帶；1 和 2，pSecTag2 A-PTEN-L-p53 質(zhì)粒，兩個生物學(xué)重復(fù)；3 和 4，pSecTag2 A 空載體，兩個生物學(xué)重復(fù)；M，DNA ladder。(B)正向測序結(jié)果顯示 PTEN-L leader 序列全部正確。(C)正向測序結(jié)果顯示 TP53 序列中第 2個密碼子發(fā)生了同義突變，谷氨酸 GAG 突變成了 GAA。4.3 構(gòu)建 pcDNA3.1-TP53 質(zhì)粒通過 PCR 技術(shù)獲得 TP53（圖 4.3A）后，其上游酶切位點為 HindIII，下游酶切位點為 xhoI，然后將其連接到 pcDNA3.1（+）表達載體上，使用 TAKARA 公司的 HindIII及 xhoI 快切酶對該質(zhì)粒進行酶切鑒定，結(jié)果顯示正確（圖 4.3B）。酶切鑒定后，將正確的質(zhì)粒送生工測序公司測序 TP53 的正向測序結(jié)果顯示基因序列發(fā)現(xiàn)第 6 個堿基 G 突變成 A, 即谷氨酸 GAG 突變成 GAA，視為氨基酸發(fā)生同義突變（圖 4.3C）。因突變并不會影響氨基酸的特性，則將繼續(xù)使用該基因進行特性及功能探討。

圖 4.3 構(gòu)建 pcDNA3.1-TP53 質(zhì)粒。（A）PCR 擴增 TP53 基因，在 1200 bp 左右出現(xiàn) TP5基因的條帶；1 和 2，兩個生物學(xué)重復(fù)。(B) 酶切鑒定 pcDNA3.1-TP53 質(zhì)粒，在 2000 b附近出現(xiàn) PTEN-L-P53 條帶；1，pcDNA3.1（+）空載體；2，3，4 和 5，pcDNA3.1-TP5質(zhì)粒，四個生物學(xué)重復(fù)。（C）正向測序結(jié)果顯示 TP53 序列中第 2 個密碼子發(fā)生了同義突變，谷氨酸 GAG 突變成了 GAA。4.4 PTEN-L-p53 在 HEK293T 細(xì)胞中過表達PTEN-L leader 也許能夠作為一個安全有效的載體將 p53 直接傳送至靶細(xì)胞從而發(fā)揮 p53 的生物學(xué)功能。我們將 PTEN-L leader 與野生型 TP53 基因通過 PCR 技術(shù)進行融合，形成融合基因 PTEN-L-p53。PTEN-L-p53 基因連接到 pSecTag2 A 載體上，該載體上含有翻譯起始密碼子 ATG，因此，我們在設(shè)計引物時并沒有修改 PTEN-Lleader 的起始密碼子 CTG。除此以外，pSecTag2 A 載體中包含一個鼠源的 Ig 信號肽 (ISP)，連入PTEN-L-p53 后，加在融合基因的 N 端，能夠促進該融合蛋白的分泌。pSecTag2A 中還

【參考文獻】：
期刊論文
[1]A PTEN translational isoform has PTEN-like activity[J]. Xie Zhang,Bowei Yin,Fangfang Zhu,Guochang Huang,Hong Li.  Chinese Journal of Cancer Research. 2015(05)



本文編號：3088746