研究背景肺癌是惡性腫瘤中死亡率最高的癌癥,非小細胞肺癌（NSCLC）占肺癌中85%左右,在其中占比最高。轉(zhuǎn)移和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是NSCLC惡性進展的重要表現(xiàn)。低氧作為實體瘤的一個特征,與其轉(zhuǎn)移和EMT密切相關(guān)。在NSCLC中,低氧現(xiàn)象同樣廣泛地存在。熱休克蛋白90α在腫瘤中表達廣泛增高并大量分泌到胞外成為胞外熱休克蛋白90α（eHSP90α）。eHSP90α與細胞運動密切相關(guān),同時低氧作為一種應(yīng)激因素,對促進eHSP90α分泌起重要作用。然而,eHSP90α是否介導(dǎo)低氧誘導(dǎo)的NSCLC細胞轉(zhuǎn)移和EMT尚不清楚。目的探索在低氧中NSCLC細胞系A(chǔ)549細胞的轉(zhuǎn)移和EMT變化,eHSP90α在低氧誘導(dǎo)的NSCLC轉(zhuǎn)移和EMT過程中的作用及其中涉及的機制。方法將NSCLC細胞系A(chǔ)549放到1%02、5%C02和95%N2中建立低氧細胞模型;使用流式細胞術(shù)檢測細胞的ROS含量;使用HSP90α單克隆抗體抑制胞外HSP90α以及使用人重組HSP90α刺激A549細胞;使用ERK抑制劑和AKT抑制劑抑制ERK和AKT、Transwell試驗檢測細胞的侵襲與遷移能力、Westem Blot檢... 

【文章來源】：南方醫(yī)科大學(xué)廣東省

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１?Ａ５４９細胞在低氧環(huán)境下迀移和侵襲能力的變化

否也發(fā)生了?ＥＭＴ。??將Ａ５４９細胞放于低氧下培養(yǎng)４８?ｈ后，使用顯微鏡觀察細胞形態(tài)的改變，結(jié)??果如圖２Ａ所示。常氧組細胞的形態(tài)為多角形的上皮樣細胞，低氧后的細胞變?yōu)??細長的長梭形間質(zhì)樣細胞。結(jié)果表明低氧能促進細胞從轉(zhuǎn)移能力較差的上皮表??型轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)移能力較強的間質(zhì)表型。??為進一步確認Ａ５４９細胞在低氧中是否發(fā)生了?ＥＭＴ，繼而進一步使用??Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ方法檢測細胞內(nèi)ＥＭＴ相關(guān)標(biāo)志蛋白的變化，結(jié)果如圖２Ｂ所示。??ＨＩＦｌ－ａ指示低氧模型是否成功，低氧組細胞ＨＩＦｌ－ｏｔ表達顯著增多，證明低氧細??胞模型制造成功。與細胞應(yīng)激相關(guān)的ＨＳＰ９０ａ蛋白沒有明顯變化。在ＥＭＴ標(biāo)志??蛋白中，介導(dǎo)細胞間相互聚集的粘附分子Ｅ－ｃａ顯著減少，而參與調(diào)節(jié)細胞的運??動和增殖的Ｖｉｍｅｎｔｉｎ和促進癌細胞増殖、轉(zhuǎn)移和浸潤的ａ－ＳＭＡ均顯著增多。結(jié)??果說明Ａ５４９細胞在低氧中確實發(fā)生了?ＥＭＴ，細胞間相互黏附的蛋白減少，促??進細胞形變和轉(zhuǎn)移的蛋白卻增多，兩者綜合作用后增大細胞轉(zhuǎn)移的潛能。??Ａ?；？鎮(zhèn)?Ｂ??－黎Ｕ??屬?Ｓ?ＨＳＰ９０ａ??Ｈ?Ｖｉｍｅｎｔｉｎ??？－ＳＭＡ??ＮＣＵＩ？??圖２低氧促使Ａ５４９細胞發(fā)生ＥＭＴ樣改變。（Ａ）?４８?ｈ低氧對細胞形態(tài)的改變，細胞??形態(tài)圖像使用低倍鏡（ｌ〇〇ｘ）拍攝。（Ｂ）低氧４８ｈ后

養(yǎng)箱中培養(yǎng)１２?ｈ，觀察胞外ＨＳＰ９０的分泌情況。通過超濾收集細胞培養(yǎng)液中的??蛋白，使用Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ檢測胞外的ＨＳＰ９０的蛋白量，通過細胞數(shù)量校正蛋白??上樣量，結(jié)果如圖３所示。??Ａ５９４細胞經(jīng)過１２?ｈ低氧處理后，細胞外ＨＳＰ９０ａ明顯升高，同時ＨＳＰ９０Ｐ??也有所升高。此結(jié)果說明在低氧１２ｈ后，細胞即分泌ＨＳＰ９０ａ和ＨＳＰ９０Ｐ，導(dǎo)致??細胞外液ＨＳＰ９０ｃｘ和ＨＳＰ９０Ｐ含量顯著提高。由于在Ａ５４９細胞中，ＨＩＦ－ｌａ在低??氧后３?ｈ即開始增多，低氧６?ｈ后即達到峰值，因此ＨＳＰ９０的分泌與ＨＩＦ－ｌａ的??上調(diào)密切相關(guān)。雖然ＨＳＰ９０ａ和ＨＳＰ９０Ｐ在低氧中均被大量分泌到細胞外，但是??ＨＳＰ９０Ｐ并不會促進腫瘤細胞的侵襲遷移［４９］，因此將主要探討ｅＨＳＰ９０ｔｘ對低氧??促進Ａ５４９細胞侵襲遷移以及ＥＭＴ過程的作用。??ｅＨＳＰ９０ａ?????ｅＨＳＰ９０ｐ?——．??圖３低氧促進ＨＳＰ９０ａ和ＨＳＰ９０（３分泌到胞外。低氧處理１２ｈ后，胞外ＨＳＰ９０ａ顯著??增多。


本文編號：3017197