目的:研究復(fù)方中藥CFF-1誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的凋亡作用及其相關(guān)分子機(jī)制的探討。方法:通過形態(tài)學(xué)觀察、噻唑藍(lán)（MTT）比色實(shí)驗(yàn)、CCK-8實(shí)驗(yàn)測定前列腺癌細(xì)胞的存活能力;采用DAPI染色法測定細(xì)胞核凝縮破裂;運(yùn)用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)測定前列腺癌細(xì)胞的凋亡率。再通過PI單染流式細(xì)胞術(shù)測定前列腺癌細(xì)胞的周期變化;以及采用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測PI3K/AKT/FOXO1信號(hào)通路以及其下游凋亡相關(guān)蛋白和周期相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果:復(fù)方中藥CFF-1使前列腺癌細(xì)胞周期阻滯在G1期,并呈濃度依賴性降低細(xì)胞的存活能力、增加細(xì)胞核凝縮破裂以及核小體的形成,顯著提高前列腺癌細(xì)胞的凋亡率。在分子機(jī)制上,CFF-1呈現(xiàn)濃度依賴性下調(diào)PI3K/AKT活性,降低FOXO1磷酸化水平,進(jìn)而上調(diào)FOXO1的轉(zhuǎn)錄活性,最終影響凋亡相關(guān)基因和周期相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)論:CFF-1對前列腺癌細(xì)胞的生長有顯著的抑制作用,并且通過PI3K/AKT/FOXO1信號(hào)通路誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞周期阻滯并發(fā)生凋亡,對治療前列腺癌具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。 

【文章來源】：中華男科學(xué)雜志. 2017年09期 第828-837頁 北大核心

【文章頁數(shù)】：10 頁

【部分圖文】：

CFF-1對前列腺組織細(xì)胞的形態(tài)及存活的影響

ず突钚緣姆腫踴?蒲芯俊?2．2CFF-1對前列腺癌細(xì)胞凋亡和周期的影響不同濃度CFF-1處理LNCaP和PC3細(xì)胞后，采用AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果如圖2A所示，無論是LNCaP還是PC3細(xì)胞，用CFF-1處理后，細(xì)胞均發(fā)生凋亡，而且細(xì)胞凋亡率都隨著CFF-1的濃度增加而顯著增加。同樣，不同濃度的CFF-1處理過的LNCaP和PC3細(xì)胞進(jìn)行DAPI染色分析細(xì)胞核凝縮破裂情況時(shí)，也發(fā)現(xiàn):CFF-1的處理促進(jìn)細(xì)胞核的凝縮、破裂和凋亡小體的形成，并且隨著CFF-1濃度的增加，細(xì)胞核凝縮、破裂和核小體形成的情況也顯著增多(如圖2C所示)。此外，采用PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化，結(jié)果如圖2B所示，CFF-1處理LNCaP和PC3細(xì)胞后，處于G1期細(xì)胞數(shù)量明顯增加，而且，隨著CFF-1濃度增加，G1期細(xì)胞數(shù)也明顯增加，說明:CFF-1處理細(xì)胞后，細(xì)胞周期主要阻滯在G1期。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CFF-1能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡和誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。圖2CFF-1對前列腺癌細(xì)胞凋亡和周期的影響(A)LNCaP和PC3細(xì)胞分別用不同濃度CFF-1處理后，用Annexin-V-FITC/PI雙染，在流式細(xì)胞儀上分析細(xì)胞凋亡情況;(B)LNCaP和PC3細(xì)胞分別用不同濃度CFF-1處理后，用PI單染，在流式細(xì)胞儀上分析細(xì)胞周期;(C)不同濃度CFF-1處理細(xì)胞24h后，用DAPI染色在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的聚縮破裂情況Figure2．EffectsofCFF-1ontheapoptosisandcellcycleoftheprostatecancerLNCaPandPC3cellsA:ApoptosisoftheprostatecancerLNCaPandPC3cellsaftertreatedwithCFF-1at0，2，5，or10mg/mlfor24hoursdeterminedbyAnnexin-V-FITC/PIdoublestainingandflowcytometry;B:cellcycleoftheprostatecancerLNCaPandPC3cellsaftertreatedwithCFF-1at0，2，5，or10mg/mlfor24hoursdeterminedbyPIstainingan

AKT信號(hào)通路的直接下游靶分子，并且FOXO1在前列腺癌細(xì)胞中扮演重要角色。因此，我們檢測了PI3K/AKT下游FOXO1(Ser256位點(diǎn))的磷酸化水平，結(jié)果如圖3C和3D所示:CFF-1處理細(xì)胞后，無論是LNCaP細(xì)胞還是PC3細(xì)胞，其FOXO1(Ser256)的磷酸化受到明顯抑制，磷酸化水平明顯下降;而且其受抑制程度也隨著CFF-1濃度的增加而顯著增加，但FOXO1總蛋白水平不受CFF-1的影響。以上結(jié)果表明CFF-1抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的活性，降低FOXO1Ser256的磷酸化水平，進(jìn)而激活FOXO1的轉(zhuǎn)錄活性。圖3CFF-1調(diào)節(jié)PI3K/AKT/FOXO1信號(hào)通路活性(A)和(B)Western印跡分析不同濃度CFF-1處理過的LNCaP或PC3細(xì)胞中總的PI3K、AKT及其磷酸化水平的變化;(C)和(D)Western-blot分析不同濃度CFF-1處理過的LNCaP或PC3細(xì)胞中總的FOXO1及其磷酸化水平的變化Figure3．ＲegulatoryeffectofCFF-1ontheactivityofthePI3K/AKT/FOXO1signalingpathwayintheprostatecancerLNCaPandPC3cellsAandB:LevelsofPI3K，AKTandtheirphosphorylationintheprostatecancerLNCaPandPC3cellsaftertreatedwithCFF-1at0，2，5，or10mg/mlfor24hoursdeterminedbyWesternblot;CandD:levelsofFOXO1anditsphosphorylationintheprostatecancerLNCaPandPC3cellsaftertreatedwithCFF-1at0，2，5，or10mg/mlfor24hoursdeterminedbyWesternblot．2．4CFF-1通過PI3K/AKT/FOXO1信號(hào)通路誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞發(fā)生線粒體依賴和非依賴的細(xì)胞凋亡我們知道，F(xiàn)OXO1Ser256位點(diǎn)的磷酸化水平降低，意味著可以進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性的FOXO1分子數(shù)就增加，其下游與細(xì)胞生長和細(xì)胞凋亡相關(guān)的一系列基因的表達(dá)就會(huì)受到影響，并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生外在途徑和線粒體途徑的細(xì)胞凋亡［10］。由圖3可知，PI3K/AKT信號(hào)通路活性下降、FOXO1Ser25


本文編號(hào)：2904195