在全球范圍內(nèi)肺癌已是由癌癥引發(fā)死亡最主要的因素。在中國(guó),肺癌的發(fā)生率和死亡率均位居癌癥中第一位。miRNA是一類小的內(nèi)源性的非編碼單鏈RNA分子,長(zhǎng)度約為18-25個(gè)核苷酸,大量研究表明miRNA在包括肺癌在內(nèi)的多種癌癥中異常表達(dá),miRNA的表征或許能為肺癌的發(fā)病機(jī)制、診斷和治療的研究提供新的思路。高通量測(cè)序相較于傳統(tǒng)檢測(cè)方法,對(duì)miRNA的檢測(cè)在通量和效率上擁有無可比擬的優(yōu)勢(shì)。本論文研究主要基于高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)成套的肺癌組織和血清樣本中miRNA表達(dá)譜進(jìn)行檢測(cè)分析并篩選了miR-486-5p進(jìn)行細(xì)胞學(xué)功能研究。（1）肺癌成套組織樣本miRNA表達(dá)譜篩選:利用高通量測(cè)序技術(shù)同時(shí)對(duì)成套的肺癌癌組織、癌旁組織和正常組織中miRNA進(jìn)行表達(dá)譜篩選。在鱗癌和腺癌中分別發(fā)現(xiàn)了多種差異表達(dá)的miRNA,其中部分miRNA的表達(dá)水平從正常組織到癌旁組織再到癌組織中呈漸進(jìn)性變化趨勢(shì)。其中,鱗癌中有12種漸進(jìn)性變化趨勢(shì)的miRNA,腺癌中有3種。這些漸進(jìn)性變化的miRNA表達(dá)水平在定量PCR實(shí)驗(yàn)中獲得了證實(shí),進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)miRNA的靶基因在非小細(xì)胞肺癌通路中呈現(xiàn)顯著富集,該結(jié)果表明漸進(jìn)性變化... 

【文章來源】：東南大學(xué)江蘇省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

miRNA生物學(xué)功能的作用機(jī)制[40]

1.2.5.1 Northern BlotNorthern Blot（Northern 雜交）技術(shù)由斯坦福大學(xué) Alwine James, Kemp David和 Stark George 于 1977 年發(fā)明，是一種檢測(cè) RNA 表達(dá)水平的方法。其命名實(shí)際上依照更早發(fā)明的 DNA 雜交技術(shù) Southern Blot。其原理是首先通過電泳將 RNA分子分離，然后通過互補(bǔ)配對(duì)與探針雜交來檢測(cè)目標(biāo) RNA（圖 1-4）。早在 Lee等人發(fā)現(xiàn) miRNA 之時(shí)使用的檢測(cè)方法即是 Northern Blot[26]。之后大量研究利用 Northern Blot 或改進(jìn)的雜交方法檢測(cè) miRNA[72,73]。為了提高 Northern Blot的靈敏度和特異性，研究人員使用一種鎖核酸（Locked nucleic acid, LNA）修飾的探針對(duì) miRNA 進(jìn)行檢測(cè)[74,75]。然而 Northern Blot 技術(shù)仍然存在不少缺點(diǎn)：對(duì)樣本需求量較大，實(shí)驗(yàn)相對(duì)繁瑣，周期較長(zhǎng)，而且通量和靈敏度均很低。

成反應(yīng)體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標(biāo)記的 ddNTP，通過泳和放射自顯影后可以根據(jù)電泳帶的位置確定待測(cè)分子的 DNA序列（圖1]。Sanger 測(cè)序的優(yōu)勢(shì)在于測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確，質(zhì)控環(huán)節(jié)多，測(cè)序片段長(zhǎng)，到止仍是基因檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，也是新一代測(cè)序技術(shù)基因檢測(cè)后進(jìn)行家系內(nèi)和驗(yàn)證的主要手段。但是 Sanger 測(cè)序的通量、效率和花費(fèi)是無法和新一代術(shù)相比（新一代測(cè)序技術(shù)在 1.3 節(jié)中介紹）。截至目前測(cè)序技術(shù)共經(jīng)歷了三一代 Sanger 測(cè)序到二代高通量測(cè)序，再到三代單分子測(cè)序。至今 40 年時(shí)序技術(shù)已經(jīng)取得了巨大的發(fā)展和突破。測(cè)序技術(shù)的每一次變革，都對(duì)基因、疾病醫(yī)療研究、藥物研發(fā)、育種等眾多領(lǐng)域產(chǎn)生了巨大的推動(dòng)作用（圖 1-高通量測(cè)序相較于傳統(tǒng)檢測(cè)方法，對(duì) miRNA 的檢測(cè)在通量和效率上擁比擬的優(yōu)勢(shì)，能直接檢測(cè) miRNA 的拷貝數(shù)，而且能夠發(fā)現(xiàn)和鑒定新的 miR序技術(shù)尤其是高通量測(cè)序平臺(tái)出現(xiàn)時(shí)起就被廣泛應(yīng)用于 miRNA 的檢測(cè)和（詳見 1.3.2 節(jié)）。


本文編號(hào)：2900041