在全球范圍內(nèi)肺癌已是由癌癥引發(fā)死亡最主要的因素。在中國,肺癌的發(fā)生率和死亡率均位居癌癥中第一位。miRNA是一類小的內(nèi)源性的非編碼單鏈RNA分子,長度約為18-25個核苷酸,大量研究表明miRNA在包括肺癌在內(nèi)的多種癌癥中異常表達,miRNA的表征或許能為肺癌的發(fā)病機制、診斷和治療的研究提供新的思路。高通量測序相較于傳統(tǒng)檢測方法,對miRNA的檢測在通量和效率上擁有無可比擬的優(yōu)勢。本論文研究主要基于高通量測序技術(shù)對成套的肺癌組織和血清樣本中miRNA表達譜進行檢測分析并篩選了miR-486-5p進行細胞學功能研究。（1）肺癌成套組織樣本miRNA表達譜篩選:利用高通量測序技術(shù)同時對成套的肺癌癌組織、癌旁組織和正常組織中miRNA進行表達譜篩選。在鱗癌和腺癌中分別發(fā)現(xiàn)了多種差異表達的miRNA,其中部分miRNA的表達水平從正常組織到癌旁組織再到癌組織中呈漸進性變化趨勢。其中,鱗癌中有12種漸進性變化趨勢的miRNA,腺癌中有3種。這些漸進性變化的miRNA表達水平在定量PCR實驗中獲得了證實,進一步分析發(fā)現(xiàn)差異表達miRNA的靶基因在非小細胞肺癌通路中呈現(xiàn)顯著富集,該結(jié)果表明漸進性變化... 

【文章來源】：東南大學江蘇省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

【部分圖文】：

miRNA生物學功能的作用機制[40]

1.2.5.1 Northern BlotNorthern Blot（Northern 雜交）技術(shù)由斯坦福大學 Alwine James, Kemp David和 Stark George 于 1977 年發(fā)明，是一種檢測 RNA 表達水平的方法。其命名實際上依照更早發(fā)明的 DNA 雜交技術(shù) Southern Blot。其原理是首先通過電泳將 RNA分子分離，然后通過互補配對與探針雜交來檢測目標 RNA（圖 1-4）。早在 Lee等人發(fā)現(xiàn) miRNA 之時使用的檢測方法即是 Northern Blot[26]。之后大量研究利用 Northern Blot 或改進的雜交方法檢測 miRNA[72,73]。為了提高 Northern Blot的靈敏度和特異性，研究人員使用一種鎖核酸（Locked nucleic acid, LNA）修飾的探針對 miRNA 進行檢測[74,75]。然而 Northern Blot 技術(shù)仍然存在不少缺點：對樣本需求量較大，實驗相對繁瑣，周期較長，而且通量和靈敏度均很低。

成反應(yīng)體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標記的 ddNTP，通過泳和放射自顯影后可以根據(jù)電泳帶的位置確定待測分子的 DNA序列（圖1]。Sanger 測序的優(yōu)勢在于測序結(jié)果準確，質(zhì)控環(huán)節(jié)多，測序片段長，到止仍是基因檢測的金標準，也是新一代測序技術(shù)基因檢測后進行家系內(nèi)和驗證的主要手段。但是 Sanger 測序的通量、效率和花費是無法和新一代術(shù)相比（新一代測序技術(shù)在 1.3 節(jié)中介紹）。截至目前測序技術(shù)共經(jīng)歷了三一代 Sanger 測序到二代高通量測序，再到三代單分子測序。至今 40 年時序技術(shù)已經(jīng)取得了巨大的發(fā)展和突破。測序技術(shù)的每一次變革，都對基因、疾病醫(yī)療研究、藥物研發(fā)、育種等眾多領(lǐng)域產(chǎn)生了巨大的推動作用（圖 1-高通量測序相較于傳統(tǒng)檢測方法，對 miRNA 的檢測在通量和效率上擁比擬的優(yōu)勢，能直接檢測 miRNA 的拷貝數(shù)，而且能夠發(fā)現(xiàn)和鑒定新的 miR序技術(shù)尤其是高通量測序平臺出現(xiàn)時起就被廣泛應(yīng)用于 miRNA 的檢測和（詳見 1.3.2 節(jié)）。


本文編號：2900041