目的:研究炎性小體NLRP6與P53在結(jié)直腸癌中的關(guān)系。方法:對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116 P53 WT（WT）和HCT116 P53-/-（KO）中的基因NLRP6進(jìn)行干擾,構(gòu)建NLRP6-ShRNA穩(wěn)定細(xì)胞株;通過Real-TimePCR以及Western Blot驗(yàn)證NLRP6敲減效率;CCK-8以及Transwell測(cè)定成功構(gòu)建的NLRP6-ShRNA穩(wěn)定細(xì)胞株的增殖遷移能力;細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)測(cè)定NLRP6在細(xì)胞中的表達(dá)情況;流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定NLRP6對(duì)細(xì)胞凋亡的影響;通過Western Blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè) NF-κB、MDM2、P53、P21WAF1/CIP1以及 CyclinB1 蛋白水平。結(jié)果:成功構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株WT CTRL、WT NLRP6-ShRNA、KO CTRL和KO NLRP6-ShRNA。NLRP6敲減效率在基因水平和蛋白水平都超過70%。在WT和KO細(xì)胞中敲減NLRP6都促進(jìn)了細(xì)胞的增殖和遷移;而且KO NLRP6-ShRNA的增殖遷移比WT NLRP6-ShRNA明顯。通過細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)NLRP6在胞漿表達(dá)。敲減NLRP6后,結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡減少... 

【文章來源】：廈門大學(xué)福建省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：81 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

人類NOD樣受體家族蛋白結(jié)構(gòu)和分類〔叨

程是裝配ＮＬＲＰ３，ＡＳＣ以及Ｃａｓｐａｓｅ－１前體形成一＂復(fù)合物。這促使Ｃａｓｐａｓｅ－１??前體轉(zhuǎn)變成Ｃａｓｐａｓｅ－１，同時(shí)也分泌ＩＬ－１８和ＩＬ－１Ｐ［４４＿４６］。目前，有三個(gè)模型來??描述炎性小體激活第二步（圖１．２）?［２５］。然而，所有模型都證明ＮＬＲＰ３不直接??與外源性激動(dòng)劑反應(yīng)，而是通過ＮＬＲＰ３感知大部分的病原體。第一個(gè)模型中，??細(xì)胞外的ＡＴＰ?（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ?ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ），作為ＮＬＲＰ３的激動(dòng)劑，通過Ｐ２Ｘ７依??賴ＰＡＮＸ－１?（Ｐａｎｎｅｘｉｎ－１）通道誘導(dǎo)鉀離子外流；從而，激活和組裝炎性小體??ＮＬＲＰ３。與此模型一致，鉀離子外流是炎性小體ＮＬＲＰ３主要的激動(dòng)劑，而胞外??４??

確定目的基因ＮＬＲＰ６蛋白表達(dá)水平。我們進(jìn)一步推進(jìn)實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建好的結(jié)??直腸癌細(xì)胞系?ＷＴ?ＣＴＲＬ?與?ＷＴ?ＮＬＲＰ６＿ＳｈＲＮＡ?以及?Ｋ０?ＣＴＲＬ?與?ＫＯ?ＮＬＲＰ６－ＳｈＲＮＡ，??培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，提取蛋白，變性，蛋白定量。結(jié)果圖３．３所示，??＾?＃??＾?１?＇??ｓ?ｉ?ｉ?彥??＾?＃?＃?＃??ＮＬＲＰ６?＼ｍｍｕｍｍｍ??（３－ａｃｔｉｎ?＿ｍｎｍｈｈｈ??圖３．?３?Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞系敲減ＮＬＲＰ６的表達(dá)情況??我們使用３－ａｃｔｉｎ管家基因作為內(nèi)部參照，管家基因在細(xì)胞中恒定表達(dá)，??基本不受到任何分子干擾。上述ＷＴ?ＣＴＲＬ，ＷＴ?ＮＬＲＰ６－ＳｈＲＮＡ，ＫＯ?ＣＴＲＬ和Ｋ０??ＮＬＲＰ６－ＳｈＲＮＡ四株細(xì)胞，３－ａｃｔｉｎ的表達(dá)量基本相同，說明每個(gè)細(xì)胞株的總蛋??白一致；同時(shí)，在ＷＴ?ＮＬＲＰ６－ＳｈＲＮＡ和ＫＯ?ＮＬＲＰ６－ＳｈＲＮＡ中，ＮＬＲＰ６的表達(dá)水平??３７??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]上海市2003～2007年大腸癌發(fā)病率和死亡率分析[J]. 李德錄,吳春曉,鄭瑩,仲偉鑒,吳凡.  中國(guó)腫瘤. 2011(06)



本文編號(hào)：2895635