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SALL4調(diào)控CD44在胃癌中的作用和機(jī)制研究

發(fā)布時(shí)間:2017-04-06 14:46

  本文關(guān)鍵詞:SALL4調(diào)控CD44在胃癌中的作用和機(jī)制研究,,由筆耕文化傳播整理發(fā)布。


【摘要】:目的:探討人婆羅雙樹樣基因4(spalt-like transcription factor 4,SALL4)在胃癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中的作用,揭示SALL4調(diào)控CD44的作用及機(jī)制,為闡明SALL4促癌作用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù),并為胃癌分子診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。方法:采用慢病毒介導(dǎo)sh RNA基因干擾或四環(huán)素誘導(dǎo)sh RNA基因干擾人胃癌MGC-803細(xì)胞SALL4表達(dá),采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)干擾效率;生長(zhǎng)曲線和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力;劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和遷移能力。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)SALL4基因干擾對(duì)干性相關(guān)基因表達(dá)以及信號(hào)通路活化的影響。雙熒光素酶報(bào)告基因分析SALL4對(duì)CD44啟動(dòng)子活性影響;染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(chromatin immunoprecipitation,Ch IP)檢測(cè)SALL4蛋白與CD44啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合情況。采用生長(zhǎng)曲線、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)以及裸鼠皮下荷瘤實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)CD44回補(bǔ)對(duì)sh RNA基因干擾SALL4胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果:實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot結(jié)果表明sh RNA直接干擾或四環(huán)素誘導(dǎo)sh RNA基因干擾均可有效降低MGC-803細(xì)胞SALL4表達(dá);SALL4基因干擾導(dǎo)致胃癌細(xì)胞增殖能力和遷移能力降低。SALL4基因減低可顯著抑制干性分子Oct4、Sox2、Nanog、c-Myc和CD44基因及蛋白表達(dá),并且可抑制ERK1/2、NF-κB和STAT3信號(hào)通路活化。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果表明,基因干擾SALL4抑制CD44啟動(dòng)子活性。Ch IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SALL4蛋白結(jié)合CD44啟動(dòng)子區(qū)-505 bp~-305 bp區(qū)域。CD44回補(bǔ)可逆轉(zhuǎn)SALL4基因干擾引起的胃癌細(xì)胞體外增殖和遷移能力抑制以及體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)抑制。結(jié)論:SALL4通過上調(diào)CD44促進(jìn)胃癌細(xì)胞體外增殖、遷移和體內(nèi)致瘤能力。SALL4轉(zhuǎn)錄調(diào)控CD44是其發(fā)揮促胃癌作用的新機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】:SALL4 CD44 胃癌 增殖 轉(zhuǎn)移
【學(xué)位授予單位】:江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2016
【分類號(hào)】:R735.2
【目錄】:
  • 摘要5-7
  • ABSTRACT7-14
  • 第一章 緒論14-24
  • 1.1 干細(xì)胞因子SALL414-20
  • 1.1.1 SALL4的基本生物學(xué)性質(zhì)14-15
  • 1.1.2 SALL4與干細(xì)胞和發(fā)育15-16
  • 1.1.3 SALL4在腫瘤中的作用16-18
  • 1.1.4 SALL4作用的分子機(jī)制18-20
  • 1.2 細(xì)胞表面粘附分子CD4420-22
  • 1.2.1 CD44的結(jié)構(gòu)20-21
  • 1.2.2 CD44在胃癌中的作用21-22
  • 1.2.3 CD44的表達(dá)調(diào)控22
  • 1.3 小結(jié)22-24
  • 第二章 研究目的、方法、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和意義24-27
  • 2.1 研究目的24
  • 2.2 研究方法24-25
  • 2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案25-26
  • 2.4 研究意義26-27
  • 第三章 shRNA干擾SALL4表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響27-43
  • 3.1 材料27-30
  • 3.1.1 細(xì)胞株27
  • 3.1.2 主要試劑27-29
  • 3.1.3 主要儀器和耗材29-30
  • 3.2 方法30-36
  • 3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)30
  • 3.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染30
  • 3.2.3 總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄PCR30-31
  • 3.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR31
  • 3.2.5 總蛋白提取31-32
  • 3.2.6 Western blot32
  • 3.2.7 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線32-33
  • 3.2.8 平板克隆形成測(cè)定33
  • 3.2.9 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)33
  • 3.2.10 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)33
  • 3.2.11 Tet-On誘導(dǎo)系統(tǒng)慢病毒載體構(gòu)建及誘導(dǎo)33-35
  • 3.2.12 統(tǒng)計(jì)分析35-36
  • 3.3 結(jié)果36-41
  • 3.3.1 MGC-803細(xì)胞直接干擾SALL4效率鑒定36
  • 3.3.2 直接干擾SALL4表達(dá)對(duì)MGC-803細(xì)胞體外增殖能力的影響36-37
  • 3.3.3 直接干擾SALL4表達(dá)對(duì)MGC-803細(xì)胞體外遷移能力的影響37-39
  • 3.3.4 Tet-On系統(tǒng)介導(dǎo)SALL4干擾效率驗(yàn)證39
  • 3.3.5 Tet-On系統(tǒng)介導(dǎo)SALL4干擾對(duì)MGC-803細(xì)胞體外增殖能力的影響39-40
  • 3.3.6 Tet-On系統(tǒng)介導(dǎo)SALL4干擾對(duì)MGC-803細(xì)胞體外遷移能力的影響40-41
  • 3.4 討論41-43
  • 第四章 胃癌細(xì)胞中SALL4對(duì)CD44的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用43-55
  • 4.1 材料43-45
  • 4.1.1 細(xì)胞株43
  • 4.1.2 主要試劑43-44
  • 4.1.3 主要儀器及相關(guān)耗材44-45
  • 4.2 方法45-48
  • 4.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)45
  • 4.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染45
  • 4.2.3 總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄PCR45
  • 4.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR45
  • 4.2.5 總蛋白提取45
  • 4.2.6 Western blot45
  • 4.2.7 CD44啟動(dòng)子區(qū)域熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建45-46
  • 4.2.8 熒光素酶報(bào)告基因分析46-47
  • 4.2.9 ChIP47-48
  • 4.2.10 統(tǒng)計(jì)分析48
  • 4.3 結(jié)果48-52
  • 4.3.1 MGC-803細(xì)胞中SALL4對(duì)下游靶基因表達(dá)的影響48-49
  • 4.3.2 MGC-803細(xì)胞中SALL4對(duì)關(guān)鍵腫瘤信號(hào)通路的影響49-50
  • 4.3.3 SALL4調(diào)控CD44熒光素酶報(bào)告基因活性50-51
  • 4.3.4 SALL4蛋白結(jié)合CD44啟動(dòng)子區(qū)域51-52
  • 4.4 討論52-55
  • 第五章 SALL4轉(zhuǎn)錄激活CD44表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞體內(nèi)外生物學(xué)特性的影響55-63
  • 5.1 材料55-56
  • 5.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物55
  • 5.1.2 細(xì)胞株55
  • 5.1.3 主要試劑55
  • 5.1.4 主要儀器和耗材55-56
  • 5.2 方法56-58
  • 5.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)56
  • 5.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染56
  • 5.2.3 總蛋白提取56
  • 5.2.4 Western blot56
  • 5.2.5 生長(zhǎng)曲線測(cè)定56
  • 5.2.6 平板克隆形成測(cè)定56
  • 5.2.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)56-57
  • 5.2.8 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)57
  • 5.2.9 裸鼠皮下荷瘤模型57
  • 5.2.10 免疫組織化學(xué)染色57-58
  • 5.2.11 腫瘤組織病理分析58
  • 5.2.12 統(tǒng)計(jì)分析58
  • 5.3 結(jié)果58-62
  • 5.3.1 MGC-803 SALL4干擾細(xì)胞株CD44回補(bǔ)效率鑒定58
  • 5.3.2 CD44回補(bǔ)對(duì)SALL4干擾細(xì)胞株體外增殖能力的影響58-59
  • 5.3.3 CD44回補(bǔ)對(duì)SALL4干擾細(xì)胞株體外遷移能力的影響59-60
  • 5.3.4 SALL4干擾及CD44回補(bǔ)對(duì)MGC-803細(xì)胞裸鼠體內(nèi)成瘤能力影響60-62
  • 5.4 討論62-63
  • 第六章 結(jié)論與展望63-64
  • 6.1 結(jié)論63
  • 6.2 展望63-64
  • 參考文獻(xiàn)64-72
  • 致謝72-74
  • 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的科研成果及參加會(huì)議74-75
  • 一、科研成果74
  • 二、參加會(huì)議74-75
  • 三、獲獎(jiǎng)情況75

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本文編號(hào):289034

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