作為最常見的惡性腫瘤之一,結(jié)直腸癌在世界范圍內(nèi)死亡率居高不下,其主要原因是腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移問題一直未能很好解決。腫瘤微環(huán)境對(duì)結(jié)直腸癌的作用越來越受到關(guān)注。癌相關(guān)成纖維細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境重要組成成分之一。前期實(shí)驗(yàn)我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和遷移,發(fā)揮促癌作用;正常成纖維細(xì)胞(NFs)能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和遷移,發(fā)揮抑癌作用,并證實(shí)Cx43參與其中。那么Cx43在成纖維細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞相互作用過程中到底發(fā)生了哪些變化?其變化的意義何在?這將是本研究中需要解決的問題。本研究繼續(xù)借助我們已經(jīng)建立的微環(huán)境細(xì)胞模型,即成纖維細(xì)胞上清條件培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞,在已有實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,深入探究Cx43在腫瘤-間質(zhì)相互作用發(fā)揮的功能及可能機(jī)制。結(jié)直腸癌細(xì)胞選用腫瘤細(xì)胞系SW620,SW480和RKO,成纖維細(xì)胞選用人胚肺成纖維細(xì)胞系HELF和用TGF-β人工活化的HELF以及從結(jié)直腸癌病理標(biāo)本中分離提純的原代正常成纖維細(xì)胞NFs和癌相關(guān)成纖維細(xì)胞CAFs。研究首先成功建立腫瘤微環(huán)境與腫瘤細(xì)胞相互作用模型,將腫瘤細(xì)胞用成纖維細(xì)胞上清條件共培養(yǎng),通過Western Blot方法證實(shí)SW620細(xì)胞經(jīng)NFs上清條件培養(yǎng)2d和4d,其上皮標(biāo)記物E-cadherin在培養(yǎng)4d時(shí)表達(dá)上調(diào)顯著,間質(zhì)標(biāo)記物Fibronectin表達(dá)下調(diào)且Vimentin在培養(yǎng)2d和4d時(shí)表達(dá)均下調(diào)顯著,Wnt通路相關(guān)蛋白DVL3表達(dá)下調(diào)且Phospho-β-Catenin(s552)s552在培養(yǎng)2d和4d時(shí)表達(dá)均下調(diào)顯著;雙熒光素酶報(bào)告基因活性實(shí)驗(yàn)證實(shí)腫瘤細(xì)胞經(jīng)NFs上清條件培養(yǎng)2d,Wnt信號(hào)通路被抑制。Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SW620細(xì)胞經(jīng)HELF及CAFs上清條件共培養(yǎng)2d和4d,Cx43表達(dá)上調(diào),尤以第4d更明顯。其次,通過成功構(gòu)建結(jié)直腸癌細(xì)胞Cx43穩(wěn)定敲降及穩(wěn)定過表達(dá)載體,進(jìn)一步研究Cx43功能。Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)證明,胞漿高表達(dá)Cx43的SW620細(xì)胞侵襲和遷移能力減弱,胞漿低表達(dá)Cx43的SW480細(xì)胞侵襲和遷移能力增強(qiáng)。CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證實(shí)胞漿高表達(dá)Cx43的RKO細(xì)胞增殖能力減弱。GSEA分析證明Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因在RKO細(xì)胞胞漿Cx43低表達(dá)處富集。但是TCGA和GEO mRNA數(shù)據(jù)庫卻證實(shí)結(jié)直腸癌樣本中高表達(dá)GJA1(編碼蛋白Cx43)呈現(xiàn)不良預(yù)后。TCGA mRNA數(shù)據(jù)庫相關(guān)性分析顯示在結(jié)直腸癌樣本中,GJA1與EMT上皮標(biāo)志物CDH1(編碼蛋白E-cadherin)呈負(fù)相關(guān),與間質(zhì)標(biāo)志物CDH2(編碼蛋白N-cadherin)及VIM(Vimentin)呈正相關(guān)。隨后通過TCGA數(shù)據(jù)庫信息證實(shí)在結(jié)直腸癌樣本中GJA1與CTNNB1(編碼蛋白β-catenin)呈正相關(guān)。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)Cx43與β-catenin相互作用。激光掃描共聚焦顯微鏡顯示與NFs上清條件培養(yǎng),SW480細(xì)胞中Cx43胞漿表達(dá)增加,Cx43未入核;與CAFs上清條件培養(yǎng),SW480細(xì)胞中Cx43發(fā)生入核,與β-catenin共同在核內(nèi)定位。對(duì)SW620細(xì)胞進(jìn)行相同處理得到一致的結(jié)果。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TGF-β促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞Cx43入核。Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)證明,核內(nèi)表達(dá)Cx43的SW480細(xì)胞侵襲和遷移能力增強(qiáng)。雙熒光素酶報(bào)告基因活性實(shí)驗(yàn)證實(shí)CAFs促進(jìn)SW620細(xì)胞Wnt信號(hào)通路活化。直接用TGF-β刺激SW620得到相同的結(jié)果。通過上述實(shí)驗(yàn),我們得到以下結(jié)論:1.NFs抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT及Wnt信號(hào)通路,CAFs促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞Wnt信號(hào)通路活化;2.CAFs顯著上調(diào)腫瘤細(xì)胞Cx43表達(dá);3.胞漿高表達(dá)Cx43的腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移及細(xì)胞增殖能力減弱,Wnt信號(hào)通路被抑制,而胞核表達(dá)Cx43的結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和遷移能力增強(qiáng),Wnt信號(hào)通路被活化;4.CAFs借助TGF-β促進(jìn)腫瘤細(xì)胞Cx43入核,在核內(nèi)與β-catenin發(fā)生相互作用。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.3
【部分圖文】：

常上皮細(xì)胞發(fā)生癌變形成腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞與其周圍的免疫細(xì)胞、血管、成纖維細(xì)??同構(gòu)成腫瘤微環(huán)境。??隙連接蛋白４３?（ｃｏｎｎｅｘｉｎ?４３，?Ｃｘ４３）是連接子蛋白家族的一員，也是人體??最廣泛的連接子蛋白。Ｃｘ４３是一種４次跨膜蛋白，其羧基端和氨基端均位??中，包含２個(gè)胞外環(huán)和１個(gè)胞內(nèi)環(huán)｜９。Ｃｘ４３羧基端包含多個(gè)結(jié)構(gòu)域，且具??磷酸化位點(diǎn)。Ｃｘ４３可通過建立細(xì)胞間縫隙連接通訊２０?（ｇａｐ?ｊｕｎｃｔｉｏｎ??ｌｌｕｌａｒ?ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，?ＧＪＩＣ）發(fā)揮發(fā)揮通道依賴作用，例如在肝臟中，ＧＪＩＣ??蛋白分泌、Ｐ４５０同工酶形成和膽汁分泌等等，ＧＪＩＣ異常，會(huì)導(dǎo)致多種疾病??可不通過ＧＪＩＣ發(fā)揮非通道依賴的作用，如Ｃｘ４３可以通過參與ＥＲＫ１／２和??號(hào)通路促進(jìn)腎系膜細(xì)胞增殖２２，參與調(diào)控Ｎｏｔｃｈ２３、ＮＦ－ｋＢ２４，?Ｗｎｔ／（３－ｃａｔｅｎｉｎ２５??２６等多條信號(hào)通路。??前大部分研究支持Ｃｘ４３發(fā)揮腫瘤抑制作用２７＇２８。過表達(dá)Ｃｘ４３能夠抑制腫??２９

（Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）??Ａ?Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ?和?Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ?蛋白檢測(cè)電泳圖??Ｂ為ＮＦｓ上清培養(yǎng)２ｄ時(shí)，半定量結(jié)果（＊戶＜０．０５）??Ｃ為ＮＦｓ上清培養(yǎng)４ｄ時(shí)，半定量結(jié)果（＊Ｐ＜０．０５，?＊＊尸＜０．０１）??表５結(jié)直腸癌細(xì)胞經(jīng)ＮＦｓ上清培養(yǎng)２ｄＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ和Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ蛋白表??迗??檢測(cè)蛋白?組別?（均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差）“直?尸值??ＳＷ６２０?０．７９９±０．００６?０．３９２??Ｅ－ｃａｄｈｅｎｎ?ＳＷ６２０－ＮＦ－ＣＭ?０．８０４±０．０４０?ｎｓ??ＳＷ６２０?０．８８０±０．０６８?１．１０５??Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ?ＳＷ６２０－ＮＦ－ＣＭ?０．７６６±０．０３５?ｎｓ??ＳＷ６２０?０．３５４±０．０１１７?５．８０６??Ｖｉｍｅｎｔｍ?ＳＷ６２０－ＮＦ－ＣＭ?０．１７１±０．０３０?ｖｓ．ＳＷ６２０，?Ｐ＜０．０５??

Ａ?ＳＷ６２０細(xì)胞經(jīng)ＮＦｓ上清條件培養(yǎng)２ｄ和４ｄ時(shí)，ｓ５５２和ＤＶＬ３蛋白表達(dá)下調(diào)（Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）??Ｂ為ＮＦｓ上清培養(yǎng)２ｄ時(shí)，ＳＷ６２０細(xì)胞ｓ５５２和ＤＶＬ３半定量結(jié)果（ＭＹＣＯ．ＯＯＩ）??Ｃ為ＮＦｓ上清培養(yǎng)４ｄ時(shí)，ＳＷ６２０細(xì)胞ｓ５５２和ＤＶＬ３半定量結(jié)果（７Ｃ０．０５）??Ｄ?ＳＷ６２０細(xì)胞經(jīng)ＮＦｓ上清條件培養(yǎng)２ｄ熒光素酶活性減弱（雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)）??（＊＊＊尸＜０＿００１?）??表７結(jié)直腸癌細(xì)胞經(jīng)ＮＦｓ上清培養(yǎng)２ｄ?ｓ５５２和ＤＶＬ３蛋白表達(dá)??纟＾?（均?差）ｔｆｉ?Ｐｆｉ??ＳＷ６２０?０．９６５±０．０２０?２３．４３??ｓ５５２??ＳＷ６２０－ＮＦ－ＣＭ?１．３００±０．００４?ｖ＾．ＳＷ６２０，?？＜０．００１??ＳＷ６２０?０．３６７士０．００８?２．５７５??ＤＶＬ３?ＳＷ６２０－ＮＦ－ＣＭ?１．０４５土０．０９８?ｎｓ??
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