肺癌是全球也是中國發(fā)病率和死亡率最高的癌癥,它也是云南省的“地方病”。非小細(xì)胞肺癌占肺癌總數(shù)的80%左右,存在易轉(zhuǎn)移和易復(fù)發(fā)的特點(diǎn),且對化療不敏感。因此探索肺癌,特別是非小細(xì)胞肺癌的新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。肺癌是一種與環(huán)境高度相關(guān)的疾病,它與大氣環(huán)境,室內(nèi)環(huán)境污染有著密切聯(lián)系。云南省的宣威和個舊地區(qū)因其地方礦產(chǎn)特點(diǎn)及生活習(xí)慣等問題,成為肺癌的高發(fā)區(qū)。肺癌還跟生活習(xí)慣,特別是吸煙有重要關(guān)系。遺傳因素促成了肺癌的人群易感性。因此,肺癌是以環(huán)境因素為主,多種因素相互作用最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)等發(fā)生異常而產(chǎn)生的癌癥。RAF/MEK/ERK屬于MAPK通路,它調(diào)控著細(xì)胞的生長,分化,轉(zhuǎn)移,凋亡等諸多過程。作為該通路的重要節(jié)點(diǎn)蛋白RAF激酶在RAF/MEK/ERK通路中發(fā)揮重要的作用,RAF家族具有三個成員:A-RAF,B-RAF和C-RAF(RAF1)。B-RAF激酶突變與許多惡性腫瘤高度相關(guān),RAF激酶異常的激活可促進(jìn)下游ERK磷酸化增強(qiáng),從而異常激活該信號通路,導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)異常分化增殖,促進(jìn)了癌癥的發(fā)生。因此,研究RAF激酶的調(diào)控機(jī)制顯得格外重要。RAF激酶是RAF/MEK/ERK信號通路主干上的重要的樞紐蛋白,利用蛋白間的相互結(jié)合間接調(diào)控激酶功能是調(diào)控蛋白功能的重要方式,所以研究RAF激酶的結(jié)合蛋白也就成了研究RAF激酶調(diào)控的重要手段。B-RAF是RAF激酶家族的重要成員,其突變體V600E與包括肺癌在內(nèi)的很多癌癥的發(fā)生有關(guān)。針對B-RAF的抑制劑已經(jīng)在臨床開始應(yīng)用,但是卻存在靶點(diǎn)異常,耐藥性等問題,為了解決這些問題,迫切需要發(fā)現(xiàn)新的,對RAF激酶具有更精準(zhǔn)更單一的結(jié)合蛋白的出現(xiàn)。因此對于RAF激酶家族尤其是B-RAF功能調(diào)控的全面解析顯得格外重要。本研究通過免疫共沉淀和多維質(zhì)譜分析的方法,建立了B-RAF的結(jié)合蛋白譜,與已經(jīng)明確的B-RAF結(jié)合蛋白比較后,得到了79個新的B-RAF結(jié)合蛋白,這些結(jié)合蛋白參與了很多細(xì)胞功能,覆蓋了腫瘤的十大特征。系統(tǒng)分析B-RAF結(jié)合蛋白的功能與機(jī)制將會對B-RAF的功能研究有重要作用。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室已有的C-RAF及A-RAF質(zhì)譜分析數(shù)據(jù),我們篩選了三個RAF激酶共同的結(jié)合蛋白RUVBL1和HAX1。RUVBL1,屬于AAA+家族成員,參與多種細(xì)胞功能,與癌癥的發(fā)生密切相關(guān),但是其機(jī)制還不清楚。我們在A549細(xì)胞中敲除了RUVBL1蛋白,并進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序,數(shù)據(jù)顯示RUVBL1敲除后,許多基因表達(dá)發(fā)生了改變,這些差異基因的功能有30%左右集中在了RAF/MEK/ERK通路,提示我們該蛋白與MAPK通路有密切聯(lián)系。因此我們針對該通路進(jìn)行了后續(xù)研究。利用基因敲除細(xì)胞系,我們進(jìn)行了肺癌細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)該蛋白的缺失會影響A549細(xì)胞的增殖,遷移,干性,血管生成等,體內(nèi)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)也確認(rèn)了RUVBL1的缺失可減弱A549成瘤能力。我們又進(jìn)行了RUVBL1與RAF/MEK/ERK通路關(guān)系分析,發(fā)現(xiàn)RUVBL1敲除后,ERK磷酸化顯著減弱,而A-RAF,B-RAF,C-RAF的表達(dá)水平無明顯變化。B-RAF(245)的磷酸化程度也沒有明顯變化,而C-RAF serine 259磷酸化程度大大增強(qiáng),作為抑制性磷酸化位點(diǎn),RUVBL1可能通路調(diào)控C-RAF serine 259磷酸來調(diào)控C-RAF功能,進(jìn)而調(diào)控RAF/MEK/ERK信號通路。HAX1,屬于熱休克蛋白結(jié)合蛋白,也參與多種細(xì)胞功能,同樣與癌癥的發(fā)生密切相關(guān),而機(jī)制尚不清。我們也在A549細(xì)胞中敲除了HAX1蛋白,并行了轉(zhuǎn)錄組測序,數(shù)據(jù)顯示HAX1敲除后,表達(dá)發(fā)生改變的基因較RUVBL1多,這些差異基因的功能有近20%左右集中在了RAF/MEK/ERK通路,提示我們該蛋白與MAPK通路有較為緊密的聯(lián)系,同時有近10%的基因功能集中在凋亡通路。因此我們針對這兩條通路進(jìn)行了初步研究。利用基因敲除細(xì)胞系,我們進(jìn)行了功能實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)該蛋白的缺失會影響A549細(xì)胞的增殖,遷移,干性,血管生成等,體內(nèi)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)也確認(rèn)了HAX1的缺失也會減弱對A549成瘤能力。同時我們進(jìn)行了多柔比星和依托泊苷的藥物敏感型實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)HAX1敲除后可以提高A549細(xì)胞對這兩種化療藥物的敏感性,尤其是多柔比星。于是,我們又進(jìn)行了凋亡檢測及動物實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)HAX1確實(shí)可以降低多柔比星的耐藥性。接下來,我們又進(jìn)行了RAF/MEK/ERK通路分析,發(fā)現(xiàn)HAX1敲除后,ERK磷酸化明顯減弱,C-RAF serine 259磷酸化程度顯著增強(qiáng),同樣,HAX1也能通過調(diào)控C-RAF serine 259磷酸來調(diào)控C-RAF功能,進(jìn)而調(diào)控RAF/MEK/ERK信號通路�？傊�,我們從互作蛋白質(zhì)組宏觀水平探究了B-RAF結(jié)合蛋白的功能及對基因的調(diào)控,成功識別了79個新的B-RAF結(jié)合蛋白;也從微觀水平探究了RAF激酶結(jié)合蛋白中RUVBL1和HAX1在腫瘤發(fā)生中的作用,初步確定RUVBL1和HAX1具有促進(jìn)肺癌發(fā)生的作用;通過轉(zhuǎn)錄組分析及質(zhì)譜分析,我們將RUVBL1和HAX1機(jī)制鎖定在RAF/MEK/ERK通路研究,發(fā)現(xiàn)二者可以通過調(diào)控C-RAF serine 259磷酸化來調(diào)控C-RAF功能,進(jìn)而調(diào)控RAF/MEK/ERK信號通路,RUVBL1和HAX1可能成為新的RAF激酶抑制劑,從而為臨床治療肺癌的提供新的研究靶標(biāo)。
【學(xué)位單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R734.2
【部分圖文】：

圖 1.1 1930-2015 期間，美國男性肺癌死亡率居癌癥首位Fig.1.1 Lung cancer mortality ranks first in cancer (male)during 1930-201the United States.1

圖 1.2 1930-2015 期間，美國女性肺癌死亡率居癌癥首位Fig.1.2 Lung cancer mortality ranks first in cancer (female)during 1930-2015 in the United States.在我國，肺癌的發(fā)病率和死亡率也居于首位。據(jù)調(diào)查，2005 年我國新發(fā)肺癌人數(shù)為，2015 年為 70 萬， 2017 年近 80 萬，預(yù)計(jì)到 2025 年將達(dá)到 110 萬。據(jù)一項(xiàng)癌癥發(fā)

圖 1.3 中國不同性別新增癌癥及死亡數(shù)量分析（2015）Fig.1.3 Estimated new cancer cases and deaths (thousands) by sex 2015）
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2887556