發(fā)布時間：2020-11-16 10:01

　　 研究背景和目的原發(fā)性肝癌是全世界范圍內(nèi)第六大常見惡性腫瘤及男性第二大致死性腫瘤。其中半數(shù)以上新發(fā)病例和死亡病例在我國,肝癌是嚴重威脅我國人民健康和生命的惡性疾病。肝癌的發(fā)生多以慢性肝臟疾病為基礎,是一個多基因、多因素參與的動態(tài)演變的過程。越來越多證據(jù)顯示肝癌微環(huán)境對肝癌的起始和進展具有重要調(diào)控作用。因此,深入研究肝癌微環(huán)境中肝癌細胞與間質(zhì)細胞或間質(zhì)成分間的相互作用,并闡明肝癌微環(huán)境調(diào)控肝癌細胞生物學行為的分子機制,對尋找有效的肝癌防治靶點具有重要意義。血小板是機體凝血系統(tǒng)的主要成分,同時還參與了組織損傷修復以及炎癥反應等過程。近年來陸續(xù)有研究報道血小板參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個過程。血液中的血小板與循環(huán)腫瘤細胞相互作用對腫瘤細胞的存活、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及穿出血管進入組織均具有至關重要的作用。另外血小板也存在于某些實體腫瘤如卵巢癌、結(jié)腸癌等的腫瘤微環(huán)境中,并與腫瘤細胞增殖、血管生成、腫瘤相關炎癥以及化療抵抗等過程相關。因此腫瘤相關血小板是非常有前景的潛在腫瘤治療靶點。多項臨床以及實驗研究已證明清除血小板或抑制其活化可明顯抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移,但潛在的出血風險限制了抗血小板療法的臨床應用。因此,尋找可有效阻斷血小板-腫瘤細胞相互作用且不影響血小板正常生理功能的靶點對腫瘤治療意義重大。肝臟是調(diào)控血小板生成和清除的重要器官。越來越多證據(jù)顯示血小板在肝臟穩(wěn)態(tài)維持以及多種肝臟疾病病理、生理過程中起關鍵作用。慢性肝病患者常伴有血小板數(shù)量或質(zhì)量的異常,已有臨床研究顯示血小板計數(shù)與肝癌患者的預后呈負相關,與癌栓形成正相關。這些研究提示血小板在肝癌發(fā)生發(fā)展中可能有不可忽視的作用。但是,血小板在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用還未闡明,肝癌微環(huán)境中的血小板如何影響肝癌細胞生物學行為還需進一步研究。腫瘤干細胞是一群具有干細胞/起始細胞特性的細胞,與腫瘤的起始、自我更新、分化以及化療抵抗等密切相關。腫瘤干細胞作為肝癌治療潛在靶點,受到越來越多研究者的關注。盡管現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種調(diào)控肝癌干細胞特性的相關轉(zhuǎn)錄因子和信號通路,腫瘤微環(huán)境對于激活和維持肝癌干細胞特性的調(diào)控作用及機制還不明確,血小板對肝癌干細胞的調(diào)控作用尚未見報道。本課題首先觀察了血小板在肝癌微環(huán)境中的積聚情況,分析了其與肝癌患者的臨床指標及預后的相關性,進一步通過抑制血小板在肝癌微環(huán)境中的積聚闡明其對肝癌進展的影響及潛在機制,以期為實現(xiàn)臨床精準血小板干預提供實驗室證據(jù),為肝癌的防治提供新的安全有效靶點。研究方法1.建立Hepa1-6細胞小鼠肝臟原位種植瘤模型、癌基因誘導(c-Met和組成性激活β-Catenin)的小鼠肝癌模型以及人肝癌細胞系Huh7裸鼠皮下荷瘤模型,檢測血小板在實驗性肝癌中的積聚情況;2.在肝癌患者術后的組織樣本中進行血小板特異染色,檢測血小板在人肝癌組織中的分布情況;3.收集肝癌患者腫瘤組織標本及臨床病例資料和預后資料,制作組織芯片,通過免疫組化法進行血小板特異標志物CD42b染色,分析腫瘤組織內(nèi)血小板聚集情況與患者總體生存期和無瘤生存期的相關性;并分析外周血小板計數(shù)與腫瘤組織內(nèi)血小板聚集情況的相關性;4.應用抗血小板藥物及清除抗體抑制血小板在腫瘤微環(huán)境中的積聚,檢測該處理對Hepa1-6細胞小鼠肝臟原位種植瘤模型、癌基因誘癌模型以及Huh7細胞裸鼠皮下荷瘤模型腫瘤生長的影響;并通過免疫組化方法檢測腫瘤組織內(nèi)增殖和干性相關標志物的表達情況;5.建立血小板-肝癌細胞共培養(yǎng)模型,分析體外條件下血小板對肝癌細胞增殖、遷移、化療藥物抵抗以及干細胞表型的影響;6.通過Western Blot、免疫熒光、定量PCR、小分子抑制劑及RNA干擾等方法研究確定NF-κB/IL-6/STAT3信號通路在血小板促進肝癌干細胞表型中的作用;7.通過血小板與肝癌細胞分隔共培養(yǎng)以及應用凝血酶(thrombin)活化血小板得到的上清和沉淀分別處理肝癌細胞的方法,明確血小板是通過分泌細胞因子還是通過直接接觸影響肝癌干細胞表型;8.利用血小板相關黏附分子的中和抗體研究何種黏附分子介導了血小板引起的肝癌干細胞擴增;9.在Huh7細胞裸鼠皮下荷瘤模型中應用血小板黏附分子中和抗體,觀察其對腫瘤生長的影響。結(jié)果1.Hepa1-6細胞小鼠肝原位移植瘤模型、癌基因誘癌模型和裸鼠Huh7皮下腫瘤組織中均存在血小板的積聚;2.臨床肝癌組織中存在不同程度的血小板積聚;3.肝癌微環(huán)境中的血小板積聚程度與肝癌患者術后總體生存期和復發(fā)時間存在負相關;肝癌微環(huán)境中的血小板積聚程度與外周血小板計數(shù)呈正相關;4.抑制肝癌微環(huán)境中的血小板積聚能顯著抑制Hepa1-6細胞原位移植瘤、癌基因誘發(fā)腫瘤和裸鼠皮下腫瘤的生長,并可顯著抑制腫瘤細胞增殖以及肝癌干細胞的擴增;5.血小板-肝癌細胞體外共培養(yǎng),促進了肝癌細胞的增殖、遷移、化療藥物抵抗以及肝癌干細胞表型等生物學行為;6.血小板通過與肝癌細胞共培養(yǎng)激活肝癌細胞內(nèi)NF-κB信號通路,促進IL-6產(chǎn)生,后者進一步激活肝癌細胞內(nèi)JAK2/STAT3信號通路,從而活化和維持肝癌干細胞表型;7.血小板通過與肝癌細胞直接接觸的方式激活了NF-κB/IL-6/STAT3信號通路;8.血小板表面分子P-selectin介導了血小板引起的肝癌細胞內(nèi)NF-κB/IL-6/STAT3信號通路的活化;9.應用P-selectin中和抗體可明顯抑制裸鼠皮下腫瘤的生長,且對小鼠凝血功能沒有影響。結(jié)論本研究結(jié)合肝癌患者的臨床隨訪資料、體內(nèi)和體外實驗證實了肝癌微環(huán)境中血小板積聚在促進肝癌進展中的關鍵作用。肝癌微環(huán)境中血小板通過其表面分子P-selectin與腫瘤細胞直接相互作用,激活腫瘤細胞內(nèi)的NF-κB信號通路并誘導IL-6的生成,后者通過自分泌和旁分泌等方式進一步活化腫瘤細胞內(nèi)JAK2/STAT3信號通路,最終促進了肝癌干細胞的擴增和肝癌的進展。阻斷P-selectin可在不影響血小板凝血功能的同時阻斷血小板-腫瘤細胞的相互作用從而影響肝癌的進展。本研究提示P-selectin是肝癌防治的潛在安全有效的靶點,為肝癌患者的個體化治療提供了新的理論依據(jù)和新策略。
【學位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R735.7
【部分圖文】：

海軍軍醫(yī)大學博士論文血小板聚集的現(xiàn)象（TCIPA）[11]，其機制與腫瘤細胞釋放的一些蛋白酶和組織因子相關，包括凝血酶、組織蛋白酶 B 和金屬蛋白酶（MMP-2/MMP-14）等有關[14]。腫瘤細胞與血小板間的相互作用主要依賴于其表面的黏附分子，包括 GPIb–IX–V 和GPIIb/IIIa 等，至今已在 MCF7 乳腺癌細胞、B16 黑色素瘤細胞和 3LL 肺癌細胞中得到證實[15, 16]。纖維蛋白原也可介導GPIIb/IIIa與腫瘤細胞表面整合素 vβ3間的結(jié)合[17]。P-selectin 則可以與腫瘤細胞表面粘蛋白發(fā)生相互作用[18]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn) TLR4在 TCIPA 和血小板促進腫瘤轉(zhuǎn)移過程中都扮演十分重要的角色[19]。

在維持微血管的穩(wěn)態(tài)中有重要作用，它們在不同器官/組織的密度有所不同[38]。此外，周細胞也有收縮和吞噬功能，有助于維持內(nèi)皮細胞的屏障功能和基底膜的形成，提高新生血管的穩(wěn)定性。在腫瘤的轉(zhuǎn)移方面，目前研究發(fā)現(xiàn)周細胞有互為矛盾的雙重作用，即既限制又促進腫瘤的轉(zhuǎn)移。一方面腫瘤血管周圍周細胞的覆蓋可能是減少腫瘤細胞經(jīng)血管漏出的重要因素，另一方面，它也幫助腫瘤細胞在復雜的血管網(wǎng)絡中經(jīng)微血管轉(zhuǎn)移[39, 40]。血小板在微環(huán)境中對周細胞的作用還不是很清楚，但是血小板內(nèi)儲存和分泌的多種因子，包括 TGF-β1、PDGF 和 AGPT-1，可以影響周細胞的分化、增殖、募集以及與內(nèi)皮細胞間的相互作用。在 B16/F10 腫瘤小鼠中出現(xiàn)血小板減少癥，腫瘤內(nèi)血管周細胞覆蓋減少并且腫瘤血管的密度降低，血管通透性增加。血小板減少使腫瘤內(nèi) TGF-β1、VEGF 和 ANGPT-1 水平降低，但是 ANGPT-2 水平升高[41]。出乎意料的是，血小板減少使血管密度降低對原發(fā)腫瘤的生長沒有影響，但是卻減少了肺轉(zhuǎn)移。周細胞的功能和覆蓋血管方式取決于器官/組織類型，血小板如何影響腫瘤微環(huán)境中的周細胞可能也與腫瘤類型以及解剖位置相關。

促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[46]。夠誘導 EMT 作用，有研究還發(fā)現(xiàn)血小板在早期轉(zhuǎn)移灶形成中也有]。血小板來源而非腫瘤細胞來源的的趨化因子 CXCL5/7，是早期所必須的[51]。相類似的研究中發(fā)現(xiàn)，血小板來源的趨化因子作用夠維持其間葉細胞的表型促進腫瘤轉(zhuǎn)移[52]。因此可見，血小板不長的信號并且可以協(xié)助原發(fā)灶腫瘤細胞到達遠處器官形成轉(zhuǎn)移灶泌TGFβ1和趨化因子之外，活化后的血小板還能夠分泌autotaxin（有磷脂酶 D 活性的酶，可以從溶血磷脂酰膽堿中分解出 LPA，有管生成和轉(zhuǎn)移[53-55]。血小板來源的微粒中含有 micro-RNA-233，可癌基因 EPB41L3 的表達進而增強肺癌細胞的侵襲能力[56]。因此微環(huán)境“種子與土壤”的學說之上，腫瘤轉(zhuǎn)移的微環(huán)境則可形容為“”，血小板就是轉(zhuǎn)移所不可或缺的“肥料”�？傊“宕龠M腫瘤以下兩個方面：首先是通過與腫瘤細胞直接作用，協(xié)助并趨化腫瘤；其次是分泌多種生長因子直接促進植入腫瘤細胞，為其生長提供細胞能夠在此安家。（如圖 3 所示）
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本文編號：2886003