目的:明確Pokemon對乳腺癌細(xì)胞(MCF7及T47D)ER、PR表達(dá)的影響,同時(shí)初步探討相關(guān)分子機(jī)制,分析Pokemon與ER、PR在臨床中的相關(guān)性。方法:本實(shí)驗(yàn)分為三部分,第一步,以體外培養(yǎng)的乳腺癌MCF7及T47D細(xì)胞為研究對象,設(shè)計(jì)Pokemon特異性siRNA,通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染將siRNA轉(zhuǎn)至MCF7及T47D細(xì)胞中,采用q-RTPCR及免疫印跡實(shí)驗(yàn)分析檢測siRNA對Pokemon的沉默情況,構(gòu)建沉默Pokemon的MCF7及T47D細(xì)胞。通過Western Blot方法了解Pokemon對ER、PR蛋白水平表達(dá)的影響,通過q-RTPCR檢測分析ER、PR核酸轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況;第二步,通過構(gòu)建ER啟動(dòng)子序列,檢測MCF7細(xì)胞中該啟動(dòng)子的表達(dá)活性。將ER啟動(dòng)子質(zhì)粒及Pokemon siRNA瞬時(shí)共轉(zhuǎn)至MCF7細(xì)胞中,應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因活性實(shí)驗(yàn)分析Pokemon對ER啟動(dòng)子活性的影響,從而探究Pokemon影響ER表達(dá)的機(jī)制;最后應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測100例非特殊型浸潤性乳腺導(dǎo)管癌組織及10例邊緣組織和50例不同病理類型的人乳腺癌組織及50例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中Pokemon及ER、PR的表達(dá)情況,分析三者在臨床中的相關(guān)性。結(jié)果1.通過q-RTPCR和Western Blot檢測證實(shí)Pokemon對乳腺癌細(xì)胞(MCF7及T47D)ER、PR的表達(dá)具有影響,沉默Pokemon可抑制ER、PR核酸轉(zhuǎn)錄及蛋白水平的表達(dá);2.通過雙熒光素酶報(bào)告基因活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沉默Pokemon可抑制MCF7細(xì)胞中ERa66啟動(dòng)子的活性表達(dá);3.分別采取100例人非特殊型浸潤性乳腺導(dǎo)管癌組織及10例邊緣組織和50例不同病理類型的人乳腺癌及50例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織進(jìn)行免疫組化染色并分析三者之間的相關(guān)性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在不同病理類型的人乳腺癌及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中Pokemon與ER、PR的表達(dá)水平具有顯著正相關(guān)。(P0.05)結(jié)論1)沉默Pokemon可抑制乳腺癌細(xì)胞(MCF7及T47D)中ER、PR的表達(dá),機(jī)制可能與沉默Pokemon能抑制ER啟動(dòng)子活性從而下調(diào)ER表達(dá)水平有關(guān)。2)在人乳腺癌組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中,Pokemon與ER、PR的表達(dá)具有顯著正相關(guān)。
【學(xué)位單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.9
【部分圖文】：

第 4 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果第 4 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1 驗(yàn)證 Pokemon siRNA 對乳腺癌 MCF7 和 T47D 細(xì)胞沉默效果為了驗(yàn)證所選擇 siRNA 在兩細(xì)胞系中對 Pokemon 的沉默效果，我們將Pokemon siRNA 通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至乳腺癌 MCF7 及 T47D 細(xì)胞中，48 小時(shí)后，通過免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)方法檢測這二者細(xì)胞系中 Pokemon 的表達(dá)情況，可以看出，以β-acting 作為參照，轉(zhuǎn)染 siRNA 后有效干擾了 MCF7 和 T47D 細(xì)胞中 Pokemon 蛋白的表達(dá)水平（圖 4.1），說明所選擇的 Pokemon siRNA 具有良好的 Pokemon 沉默效果。

究4.2.1 沉默 Pokemon 抑制乳腺癌 MCF7 和 T47D 細(xì)胞 ER、PR 的核酸轉(zhuǎn)錄水平為了探究沉默 Pokemon 對乳腺癌 MCF7 和 T47D 細(xì)胞中 ER、PR 核酸轉(zhuǎn)錄效應(yīng)的影響，我們通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 Pokemon siRNA 分別至 MCF7 及 T47D 細(xì)胞中，48 小時(shí)后，提取 RNA 并逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，通過熒光實(shí)時(shí)定量 PCR 儀檢測對照組(con)及實(shí)驗(yàn)組(siRNA）中的 Pokemon、ER 和 PR 的 mRNA 表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組中 Pokemon mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平較對照組明顯下降（圖 4.2），敲低 Pokemon 的實(shí)驗(yàn)組 ER mRNA 含量較對照組顯著下降(圖 4.3)；PR 的 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平也隨之降低（圖 4.4）。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析證實(shí)沉默 Pokemon 可抑制乳腺癌 MCF7 和 T47D 細(xì)胞中 ERa66、PR 的核酸的轉(zhuǎn)錄水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）。

圖 4.3 沉默 Pokemon 可抑制乳腺癌 MCF7 和 T47D 細(xì)胞中 ERa66 mRNA 水平的表達(dá)注：con 組：對照組，siRNA 組：實(shí)驗(yàn)組，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 Pokemon siRNA48 小時(shí)后，n=3，***P < 0.001，**P < 0.01表4.2 Pokemon 對乳腺癌MCF7和T47D細(xì)胞中ERa66核酸轉(zhuǎn)錄水平影響(Mean±SD)組別 核酸轉(zhuǎn)錄水平MCF7cell con 0.4902±0.0178siRNA 0.1253±0.0025T47Dcell con 0.1114±0.0045siRNA 0.0580±0.0045
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本文編號(hào)：2884234