乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在我國(guó)其發(fā)病率逐年上升,手術(shù)切除腫瘤結(jié)合術(shù)后放化療是乳腺癌主要的治療方法,病理類(lèi)型中以乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌最常見(jiàn),約占總80%左右[1]。Tientsin Albino 2(TA2)小鼠的自發(fā)性乳腺癌(SBC)的發(fā)生與小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)感染有關(guān),MMTV的擴(kuò)增與激素調(diào)控有關(guān)。為了探索MMTVLTR在TA2小鼠基因組中的插入位點(diǎn),利用反向PCR和嵌套PCR擴(kuò)增TA2小鼠SBC中MMTV-LTRSAG基因兩側(cè)的不確定序列和TA2小鼠的正常乳腺組織。此外,在人類(lèi)乳腺病理進(jìn)行原位雜交,包括正常乳腺組織43例、乳腺囊性增生46例、乳腺導(dǎo)管內(nèi)原位癌54例、原發(fā)性乳腺癌142例、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性乳腺癌47例。通過(guò)原位雜交的結(jié)果評(píng)價(jià)了插入位點(diǎn)的臨床病理意義。我們確認(rèn)MMTV-LTRSAG基因的插入站點(diǎn)位于TA2小鼠6號(hào)染色體上Igκv2-112與Igκv14-111之間。IGκC定位于TA2小鼠SBC和人乳腺癌組織的基質(zhì)細(xì)胞中。RNA原位雜交的結(jié)果表明,腫瘤細(xì)胞呈IGκC陰性,基質(zhì)細(xì)胞呈IGκC陽(yáng)性。IGκC基質(zhì)細(xì)胞的陽(yáng)性染色指數(shù)最高的是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性乳腺癌,其次依次是原發(fā)性乳腺癌、乳腺導(dǎo)管內(nèi)原位癌以及乳腺囊性增生。此外,IGκC陽(yáng)性染色指數(shù)還與ER、HER2和Ki-67的表達(dá)相關(guān)[2]。我們的研究結(jié)果顯示,在TA2小鼠中,基質(zhì)中IGκC的表達(dá)與SBC的發(fā)生有關(guān)。IGκC可能是一個(gè)人類(lèi)乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展的高風(fēng)險(xiǎn)因素。我們確認(rèn)了MMTV-LTRSAG基因的插入位點(diǎn)位于TA2小鼠的染色體6號(hào)染色體上Igκv2-112與Igκv14-111之間[4]。IGκC表達(dá)于TA2小鼠原發(fā)性乳腺癌與人類(lèi)乳腺癌組織的基質(zhì)細(xì)胞中。經(jīng)RNA原位雜交,腫瘤細(xì)胞IGκC表達(dá)為陰性,而間質(zhì)細(xì)胞中IGκC表達(dá)為陽(yáng)性。其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性乳腺癌表達(dá)最高,其次是乳腺原位癌,乳腺導(dǎo)管內(nèi)原位癌,乳腺囊性增生。此外,IGκC陽(yáng)性指數(shù)與ER,PR、HER2和ki-67的表達(dá)有關(guān)[5]。我們的研究結(jié)果表明,基質(zhì)中IGκC的表達(dá)與TA2小鼠原發(fā)性乳腺癌的發(fā)生有關(guān),揭示IGκC可能是人類(lèi)乳腺癌發(fā)生和發(fā)展的高危因素。在序列分析結(jié)果的基礎(chǔ)上,確定了MMTV-LTR位于TA2小鼠的6號(hào)染色體免疫球蛋白κv2-112(Igκv2-112)和Igκv14-111之間。IGκC RNA原位雜交顯示TA2小鼠SBC和人類(lèi)乳腺癌組織的基質(zhì)細(xì)胞中IGκC表達(dá)為陽(yáng)性。IGκC陽(yáng)性染色指數(shù)與人類(lèi)乳腺癌的發(fā)展程度相關(guān),同時(shí)與ER,PR,HER2,Ki-67的表達(dá)有關(guān)。腫瘤浸潤(rùn)漿細(xì)胞被認(rèn)定為IGκC的來(lái)源。本研究通過(guò)石蠟包埋組織(FFPE)經(jīng)RNA原位雜交測(cè)定確認(rèn)IGκC對(duì)于人乳腺癌的預(yù)后評(píng)估。天津醫(yī)科大學(xué)建立了自發(fā)性乳腺癌(SBC)TA2小鼠模型,經(jīng)過(guò)50多年對(duì)這個(gè)課題的研究,在這個(gè)模型中自發(fā)性乳腺癌(SBC)超過(guò)80%,SBC的發(fā)病率與妊妊娠次數(shù)有關(guān)以及與小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)感染有關(guān)。MMTV是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒,其特征是長(zhǎng)末端重復(fù)(LTRs)。MMTV類(lèi)似于LTRs的序列包含激素響應(yīng)的元素(HREs),轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子-1(TEF-1),和一個(gè)超級(jí)抗原的開(kāi)放閱讀框(ORF)。Tientsin Albino 2(TA2)小鼠的自發(fā)性乳腺癌(SBC)的發(fā)生與小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)感染有關(guān),MMTV擴(kuò)增與激素調(diào)節(jié)有著密切的關(guān)聯(lián)[3]。本文以探討MMTV-LTR在TA2小鼠基因組中的插入部位為目的,利用反向PCR和巢式PCR擴(kuò)增未知序列。MMTV-LTRSAG基因在自發(fā)性乳腺癌和TA2小鼠正常乳腺組織中均存在。在原病毒中存在的SAG基因的表達(dá)負(fù)責(zé)SAG的生產(chǎn)。MMTV啟動(dòng)子包含一個(gè)HRE,能與黃體酮、糖皮質(zhì)激素受體和雄激素受體結(jié)合促進(jìn)MMTV基因的表達(dá)。我們之前的研究證實(shí)了聯(lián)合外源性雌二醇和孕酮治療在缺失卵巢的TA2小鼠中誘發(fā)乳腺癌。作為一種逆轉(zhuǎn)錄病毒,MMTV可以將其基因組融合到TA2小鼠的基因組中。當(dāng)病毒DNA被插入或甚至接近致癌基因時(shí),它就能夠改變?cè)摶虻谋磉_(dá),導(dǎo)致癌癥的發(fā)展。MMTV在激素的刺激下尚未被激活,當(dāng)激素與重復(fù)序列TGTTCT結(jié)合,在MMTV-LTR的HRE作用下,在TA2小鼠中SBC的發(fā)生率與妊娠頻率以及MMTV感染有關(guān)。雌二醇和孕激素可與HRE結(jié)合,進(jìn)而誘發(fā)乳腺癌。在TA2小鼠中,SBC的發(fā)生可能類(lèi)似于人類(lèi)妊娠相關(guān)乳腺癌(PABC)。PABC被定義為在懷孕期間或在懷孕第一年之后診斷的乳腺癌。PABC發(fā)展的機(jī)制包括青春期激素水平變化以及孕期激素水平變化。此外,我們之前的研究證明TA2小鼠SBC是三陰性乳腺癌,三陰性乳腺癌是浸潤(rùn)性乳腺癌重要的一個(gè)類(lèi)型,腫瘤組織表達(dá)雌激素受體(ER),孕激素受體(PR)和HER2均為陰性。三陰性乳腺癌多發(fā)于年輕女性,其預(yù)后很差。目的:探討免疫球蛋白IGκC在人類(lèi)及TA2小鼠乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用。方法:本實(shí)驗(yàn)研究采用PCR,原位雜交,組織芯片和免疫組織化學(xué)方法,使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件探討乳腺各種病變中IGκC基因表達(dá)的意義,進(jìn)一步揭示IGκC基因在乳腺癌發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后中的作用。我們收集南開(kāi)大學(xué)附屬天津市人民醫(yī)院142例乳腺組織標(biāo)本,包括乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌,浸潤(rùn)性癌,囊性增生,乳腺派杰氏病,以及乳腺微乳頭癌,通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、PCR、組織芯片、免疫組化、RNA原位雜交的方法,闡明了IGκC基因與乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用以及分子機(jī)制,為乳腺癌的治療以及預(yù)后從新的角度提供更有效的分子治療靶點(diǎn),同時(shí)為乳腺癌病人的預(yù)后進(jìn)行分子標(biāo)記物方面的檢測(cè)。結(jié)果:1.在不同病變的乳腺組織中IgK基因表達(dá)的程度不同。在142例病例中IgK基因在不同乳腺病變包括正常乳腺組織、不典型增生、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤、導(dǎo)管原位癌、浸潤(rùn)性乳腺癌和轉(zhuǎn)移性乳腺癌,均有不同程度表達(dá)。2.從正常乳腺組織和乳腺癌中提取基因組和總RNA。總RNA被反向轉(zhuǎn)錄到cDNA。在MMTV3'LTR引物的基礎(chǔ)上,進(jìn)行PCR檢測(cè),正向PCR和反向PCR列表的序列的詳細(xì)信息,序列長(zhǎng)度為1090bp和1024bp。與NCBI-BLAST相比,前向PCR序列與MMTV不匹配。然而,正向PCR結(jié)果與小鼠基因組的序列相似性大于99%。與NCBI-BLAST相比,反向PCR序列是小鼠基因組的一部分。3.乳腺癌、增生乳腺組織和正常乳腺組織均為石蠟包埋,用于RNA原位雜交。IGκC RNA原位雜交結(jié)果顯示,基質(zhì)細(xì)胞是積極的。強(qiáng)烈的IGκC染色出現(xiàn)在乳腺癌的TA2,弱的染色I(xiàn)GκC存在于增生的乳腺組織,正常乳腺組織為陰性IGκC染色。細(xì)菌dapB探針的陰性對(duì)照證實(shí)了結(jié)果的可靠性。結(jié)論:1.在不同病變的乳腺組織中IgK基因表達(dá)的程度不同。2.IGκC基因的表達(dá)與乳腺不同病變相關(guān),且IGκC基因RNA原位雜交的表達(dá)強(qiáng)度與人類(lèi)乳腺癌的發(fā)展進(jìn)程有關(guān)。3.乳腺不同病變與IgK基因表達(dá)密切相關(guān),與諸多相關(guān)免疫分子密切相關(guān)。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R737.9
【部分圖文】：

cDNA中整合結(jié)果圖

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：（1）目的參照基因驗(yàn)證應(yīng)用特異引物驗(yàn)證正常小鼠與乳腺癌小鼠中 MMTV3'LTR 基因片段在cDNA 以及基因組中是否存在，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 1、圖 2 所示，與文獻(xiàn)[1]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，目的參照基因在正常小鼠中不存在，在乳腺癌小鼠中存在，證明 MMTV 有序列插入小鼠基因組中，本實(shí)驗(yàn)方案可行；

目的參照基因在正常小鼠中不存在，在乳，證明 MMTV 有序列插入小鼠基因組中，本實(shí)驗(yàn)方案可cDNA 中整合結(jié)果圖 圖 2 基因組中整合TRSAG 在小鼠基因組中整合鑒定引物對(duì) MMTV-LTRSAG 基因進(jìn)行擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度約為 130 3 所示，可以推斷 MMTV-LTRSAG 基因整個(gè)片段整合到小
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本文編號(hào)：2883451