乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,在我國其發(fā)病率逐年上升,手術切除腫瘤結合術后放化療是乳腺癌主要的治療方法,病理類型中以乳腺浸潤性導管癌最常見,約占總80%左右[1]。Tientsin Albino 2(TA2)小鼠的自發(fā)性乳腺癌(SBC)的發(fā)生與小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)感染有關,MMTV的擴增與激素調控有關。為了探索MMTVLTR在TA2小鼠基因組中的插入位點,利用反向PCR和嵌套PCR擴增TA2小鼠SBC中MMTV-LTRSAG基因兩側的不確定序列和TA2小鼠的正常乳腺組織。此外,在人類乳腺病理進行原位雜交,包括正常乳腺組織43例、乳腺囊性增生46例、乳腺導管內原位癌54例、原發(fā)性乳腺癌142例、淋巴結轉移性乳腺癌47例。通過原位雜交的結果評價了插入位點的臨床病理意義。我們確認MMTV-LTRSAG基因的插入站點位于TA2小鼠6號染色體上Igκv2-112與Igκv14-111之間。IGκC定位于TA2小鼠SBC和人乳腺癌組織的基質細胞中。RNA原位雜交的結果表明,腫瘤細胞呈IGκC陰性,基質細胞呈IGκC陽性。IGκC基質細胞的陽性染色指數最高的是淋巴結轉移性乳腺癌,其次依次是原發(fā)性乳腺癌、乳腺導管內原位癌以及乳腺囊性增生。此外,IGκC陽性染色指數還與ER、HER2和Ki-67的表達相關[2]。我們的研究結果顯示,在TA2小鼠中,基質中IGκC的表達與SBC的發(fā)生有關。IGκC可能是一個人類乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展的高風險因素。我們確認了MMTV-LTRSAG基因的插入位點位于TA2小鼠的染色體6號染色體上Igκv2-112與Igκv14-111之間[4]。IGκC表達于TA2小鼠原發(fā)性乳腺癌與人類乳腺癌組織的基質細胞中。經RNA原位雜交,腫瘤細胞IGκC表達為陰性,而間質細胞中IGκC表達為陽性。其中淋巴結轉移性乳腺癌表達最高,其次是乳腺原位癌,乳腺導管內原位癌,乳腺囊性增生。此外,IGκC陽性指數與ER,PR、HER2和ki-67的表達有關[5]。我們的研究結果表明,基質中IGκC的表達與TA2小鼠原發(fā)性乳腺癌的發(fā)生有關,揭示IGκC可能是人類乳腺癌發(fā)生和發(fā)展的高危因素。在序列分析結果的基礎上,確定了MMTV-LTR位于TA2小鼠的6號染色體免疫球蛋白κv2-112(Igκv2-112)和Igκv14-111之間。IGκC RNA原位雜交顯示TA2小鼠SBC和人類乳腺癌組織的基質細胞中IGκC表達為陽性。IGκC陽性染色指數與人類乳腺癌的發(fā)展程度相關,同時與ER,PR,HER2,Ki-67的表達有關。腫瘤浸潤漿細胞被認定為IGκC的來源。本研究通過石蠟包埋組織(FFPE)經RNA原位雜交測定確認IGκC對于人乳腺癌的預后評估。天津醫(yī)科大學建立了自發(fā)性乳腺癌(SBC)TA2小鼠模型,經過50多年對這個課題的研究,在這個模型中自發(fā)性乳腺癌(SBC)超過80%,SBC的發(fā)病率與妊妊娠次數有關以及與小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)感染有關。MMTV是一種逆轉錄病毒,其特征是長末端重復(LTRs)。MMTV類似于LTRs的序列包含激素響應的元素(HREs),轉錄增強因子-1(TEF-1),和一個超級抗原的開放閱讀框(ORF)。Tientsin Albino 2(TA2)小鼠的自發(fā)性乳腺癌(SBC)的發(fā)生與小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)感染有關,MMTV擴增與激素調節(jié)有著密切的關聯[3]。本文以探討MMTV-LTR在TA2小鼠基因組中的插入部位為目的,利用反向PCR和巢式PCR擴增未知序列。MMTV-LTRSAG基因在自發(fā)性乳腺癌和TA2小鼠正常乳腺組織中均存在。在原病毒中存在的SAG基因的表達負責SAG的生產。MMTV啟動子包含一個HRE,能與黃體酮、糖皮質激素受體和雄激素受體結合促進MMTV基因的表達。我們之前的研究證實了聯合外源性雌二醇和孕酮治療在缺失卵巢的TA2小鼠中誘發(fā)乳腺癌。作為一種逆轉錄病毒,MMTV可以將其基因組融合到TA2小鼠的基因組中。當病毒DNA被插入或甚至接近致癌基因時,它就能夠改變該基因的表達,導致癌癥的發(fā)展。MMTV在激素的刺激下尚未被激活,當激素與重復序列TGTTCT結合,在MMTV-LTR的HRE作用下,在TA2小鼠中SBC的發(fā)生率與妊娠頻率以及MMTV感染有關。雌二醇和孕激素可與HRE結合,進而誘發(fā)乳腺癌。在TA2小鼠中,SBC的發(fā)生可能類似于人類妊娠相關乳腺癌(PABC)。PABC被定義為在懷孕期間或在懷孕第一年之后診斷的乳腺癌。PABC發(fā)展的機制包括青春期激素水平變化以及孕期激素水平變化。此外,我們之前的研究證明TA2小鼠SBC是三陰性乳腺癌,三陰性乳腺癌是浸潤性乳腺癌重要的一個類型,腫瘤組織表達雌激素受體(ER),孕激素受體(PR)和HER2均為陰性。三陰性乳腺癌多發(fā)于年輕女性,其預后很差。目的:探討免疫球蛋白IGκC在人類及TA2小鼠乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中的作用。方法:本實驗研究采用PCR,原位雜交,組織芯片和免疫組織化學方法,使用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件探討乳腺各種病變中IGκC基因表達的意義,進一步揭示IGκC基因在乳腺癌發(fā)生發(fā)展以及預后中的作用。我們收集南開大學附屬天津市人民醫(yī)院142例乳腺組織標本,包括乳腺導管內癌,浸潤性癌,囊性增生,乳腺派杰氏病,以及乳腺微乳頭癌,通過動物實驗、PCR、組織芯片、免疫組化、RNA原位雜交的方法,闡明了IGκC基因與乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用以及分子機制,為乳腺癌的治療以及預后從新的角度提供更有效的分子治療靶點,同時為乳腺癌病人的預后進行分子標記物方面的檢測。結果:1.在不同病變的乳腺組織中IgK基因表達的程度不同。在142例病例中IgK基因在不同乳腺病變包括正常乳腺組織、不典型增生、導管內乳頭狀瘤、導管原位癌、浸潤性乳腺癌和轉移性乳腺癌,均有不同程度表達。2.從正常乳腺組織和乳腺癌中提取基因組和總RNA。總RNA被反向轉錄到cDNA。在MMTV3'LTR引物的基礎上,進行PCR檢測,正向PCR和反向PCR列表的序列的詳細信息,序列長度為1090bp和1024bp。與NCBI-BLAST相比,前向PCR序列與MMTV不匹配。然而,正向PCR結果與小鼠基因組的序列相似性大于99%。與NCBI-BLAST相比,反向PCR序列是小鼠基因組的一部分。3.乳腺癌、增生乳腺組織和正常乳腺組織均為石蠟包埋,用于RNA原位雜交。IGκC RNA原位雜交結果顯示,基質細胞是積極的。強烈的IGκC染色出現在乳腺癌的TA2,弱的染色IGκC存在于增生的乳腺組織,正常乳腺組織為陰性IGκC染色。細菌dapB探針的陰性對照證實了結果的可靠性。結論:1.在不同病變的乳腺組織中IgK基因表達的程度不同。2.IGκC基因的表達與乳腺不同病變相關,且IGκC基因RNA原位雜交的表達強度與人類乳腺癌的發(fā)展進程有關。3.乳腺不同病變與IgK基因表達密切相關,與諸多相關免疫分子密切相關。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R737.9
【部分圖文】：

cDNA中整合結果圖

實驗結果：（1）目的參照基因驗證應用特異引物驗證正常小鼠與乳腺癌小鼠中 MMTV3'LTR 基因片段在cDNA 以及基因組中是否存在，其實驗結果如圖 1、圖 2 所示，與文獻[1]的實驗結果相同，目的參照基因在正常小鼠中不存在，在乳腺癌小鼠中存在，證明 MMTV 有序列插入小鼠基因組中，本實驗方案可行；

目的參照基因在正常小鼠中不存在，在乳，證明 MMTV 有序列插入小鼠基因組中，本實驗方案可cDNA 中整合結果圖 圖 2 基因組中整合TRSAG 在小鼠基因組中整合鑒定引物對 MMTV-LTRSAG 基因進行擴增，獲得長度約為 130 3 所示，可以推斷 MMTV-LTRSAG 基因整個片段整合到小
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本文編號：2883451