背景與目的:腫瘤一直以來都是威脅人類健康和縮短人類壽命的一類重要原因。近年來,隨著臨床醫(yī)學(xué)的進(jìn)步,越來越多的腫瘤治療方法不斷問世,每一種治療方法在應(yīng)用于臨床之前都需要有大量的動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證以確保其有效性及安全性。早期的動物腫瘤模型構(gòu)建主要通過理化因素誘發(fā),與人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程有較大差異。所以當(dāng)下更多研究的是通過生物技術(shù)手段移植原代腫瘤細(xì)胞或誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)基因突變使實(shí)驗(yàn)動物患病的方法。本研究的探討應(yīng)用新興基因編輯技術(shù)規(guī)律性成簇的間隔短回文重復(fù)序列-核酸酶系統(tǒng)(CRISPR-Cas9)對人體內(nèi)至關(guān)重要的2個抑癌基因p53與PTEN進(jìn)行編輯的可行性,并通過體外檢測研究其編輯效果,為原代細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化及建立人源化小鼠腫瘤模型提供實(shí)驗(yàn)研究工具。方法:通過序列分析確定p53及PTEN基因各亞型m RNA剪輯的共同外顯子區(qū)域,針對該區(qū)域進(jìn)行軟件評分,設(shè)計選擇針對p53及PTEN基因的CRISPR-Cas9導(dǎo)向RNA(sgRNA)靶點(diǎn)各2個:p53-1、p53-2、PTEN-1和PTEN-2。構(gòu)建共表達(dá)sgRNA與Cas9-P2A-GFP的CRISPR-Cas9質(zhì)粒。選擇處于對數(shù)生長期的293T細(xì)胞,將其分為對照組(未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的野生型293T細(xì)胞)和實(shí)驗(yàn)組(利用Lipo-fectamine2000轉(zhuǎn)染sgRNA-Cas9-P2A-GFP共表達(dá)質(zhì)粒的293T細(xì)胞),流式細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)組綠色熒光蛋白(GFP)陽性細(xì)胞(成功轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞),2周擴(kuò)增培養(yǎng)后提取基因組DNA,PCR擴(kuò)增基因組DNA包含突變位點(diǎn)的區(qū)段,將擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳后膠回收,連接至pEASY-Blunt Zero克隆載體中,轉(zhuǎn)化,挑取單克隆菌斑培養(yǎng),提取質(zhì)粒DNA測序,對比對照組與實(shí)驗(yàn)組測序結(jié)果后確定RNA介導(dǎo)的特異基因位點(diǎn)突變效率。結(jié)果:轉(zhuǎn)染sgRNA-Cas9-P2A-GFP質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組流式細(xì)胞術(shù)分選后GFP陽性率高達(dá)82%,與分選前(4%)比較明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。對分選培養(yǎng)后的細(xì)胞提取基因組PCR位點(diǎn)的擴(kuò)增序列,比對實(shí)驗(yàn)組基因測序結(jié)果與未經(jīng)sgRNA-Cas9-P2A-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的對照組野生型細(xì)胞測序結(jié)果,p53-1、p53-2和PTEN-2誘導(dǎo)的突變效率分別為54.5%,45.5%和33.3%。結(jié)論:針對人p53及PTEN基因設(shè)計的sgRNA p53-1、p53-2和PTEN-2能夠在基因組水平較高效率地成功介導(dǎo)Cas9進(jìn)行位點(diǎn)特異性的基因編輯。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q78;R73
【部分圖文】：

第2章 材料與方法2.3 實(shí)驗(yàn)流程模式圖對實(shí)驗(yàn)整體設(shè)計思路及流程加以總結(jié)（圖 2.1），將實(shí)驗(yàn)分為兩大部分，上游sgRNA 靶點(diǎn)設(shè)計與克隆構(gòu)建作為步驟 1（SgRNA 設(shè)計與質(zhì)粒構(gòu)建），下游細(xì)胞操作與基因編輯功能驗(yàn)證部分作為步驟 2（質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與細(xì)胞分選及基因編輯效率分析）。

切割 pL-CRISPR.EFS.GFP 質(zhì)粒使其線性化，該質(zhì)粒的 sgRNA克隆位點(diǎn)兩側(cè)為一對 Esp3I 內(nèi)切酶，該酶切割位點(diǎn)在其識別位點(diǎn)的下游因而成對使用時可以產(chǎn)生不易導(dǎo)致質(zhì)粒自連的粘末端，通過合成 sgRNA 序列引物并褪火，我們可以獲得具有同樣粘性末端的 sgRNA 序列 DNA 雙鏈并連接，挑取克隆測序選擇正確插入 sgRNA 的 pL-CRISPR. EFS.GFP 質(zhì)粒。隨后利用lipo-fectamine2000將分別表達(dá)sgRNA與Cas9-P2A-GFP的CRISPR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn) 293T 細(xì)胞內(nèi)，24-48 h 內(nèi)通過熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞術(shù)分析均發(fā)現(xiàn)了 3%GFP 表達(dá)，證明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，并通過流式分選對表達(dá) GFP 轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞進(jìn)行了純化（圖 3.2）。其中圖 3.2 中 A，和 B 均為 1 次有代表性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，而 C 為 3 次流式分析結(jié)果的統(tǒng)計圖。如圖可見，與分選前的熒光比率 4%相比，分選后熒光比率升高至 82%，P<0.05，成功富集了質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功的 293T 細(xì)胞。

圖 3.3 PCR 產(chǎn)物電泳及測序結(jié)果A：p53 或 PTEN sgRNA-Cas9 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞對預(yù)期的突變發(fā)生區(qū)域擴(kuò)增 PCR 產(chǎn)的電泳圖。P53 靶向編輯質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞：M 列，marker; 1 列，p53 正常對組；2 列，轉(zhuǎn)染 p53-1 sgRNA 質(zhì)粒組；3 列，轉(zhuǎn)染 p53-2 sgRNA 質(zhì)粒組。P靶向編輯質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞：M 列，marker；1 列，轉(zhuǎn)染 PTEN-2 sgRNA 質(zhì)粒組列，轉(zhuǎn)染 PTEN-1 sgRNA 質(zhì)粒組；3 列，轉(zhuǎn)染 PTEN-2 sgRNA 質(zhì)粒對照組；4 轉(zhuǎn)染 PTEN-1 sgRNA 質(zhì)粒對照組。B：轉(zhuǎn)染 PTEN-2 sgRNA 質(zhì)粒的基因片段測序果。 C：轉(zhuǎn)染 p53-1 sgRNA 質(zhì)粒的基因片段測序結(jié)果。D：轉(zhuǎn)染 p53-2 sgRNA粒的基因片段測序結(jié)果。Fig.3.3 PCR product electrophoresis and sequencing resultsA: The PCR product electrophoresis results of the expected genomic sequence ofp53/PTEN sgRNA-Cas9 plasmid transfected cells. The PCR amplification product
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Dongyuan Ma;Feng Liu;;Genome Editing and Its Applications in Model Organisms[J];Genomics,Proteomics & Bioinformatics;2015年06期

2 殷利眷;胡斯奇;郭斐;;CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)在病毒感染疾病治療中的應(yīng)用[J];遺傳;2015年05期

本文編號：2883373