目的:腫瘤是人類面臨的巨大疾病問題,化療作為目前腫瘤的一種有效治療方式,應(yīng)用非常廣泛。但是腫瘤細(xì)胞很容易對化療藥物產(chǎn)生抗藥性,特別是腫瘤多藥耐藥的發(fā)生,很容易導(dǎo)致化療方案的失敗。uPAR對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要作用,但是關(guān)于uPAR與腫瘤多藥耐藥方面的研究報(bào)道很少。所以,本論文想研究uPAR在腫瘤多藥耐藥中所起的作用與機(jī)制。方法:1.利用R語言編程技術(shù)分析TCGA數(shù)據(jù)庫中與uPAR有關(guān)的RNA表達(dá)水平數(shù)據(jù)和臨床預(yù)后數(shù)據(jù)。2.利用CRISPR-Cas9基因敲除技術(shù)在HCT8/T和KB_(V200)當(dāng)中敲除uPAR,利用Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建過表達(dá)uPAR的重組載體,在AGS和H1299中過表達(dá)uPAR。3.利用劃痕、Transwell、Softagar、MTT、鬼筆環(huán)肽和DAPI雙染色等方法,檢測改變uPAR后對于腫瘤細(xì)胞多藥耐藥能力和增殖生長、遷移、侵襲等能力的影響情況。4.利用Western Blot來探究uPAR蛋白在腫瘤多藥耐藥中的作用機(jī)制。結(jié)果:1.TCGA數(shù)據(jù)顯示uPAR在常見的腫瘤組織中高表達(dá),且在肺腺癌和腎透明細(xì)胞癌患者中uPAR的高表達(dá)與臨床預(yù)后不良有關(guān)。2.在腫瘤多藥耐藥細(xì)胞株HCT8/T和KB_(V200)中敲除uPAR后,腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥能力減弱。而在低表達(dá)uPAR的腫瘤細(xì)胞AGS和H1299中過表達(dá)uPAR后,腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥能力增強(qiáng)。3.在腫瘤多藥耐藥細(xì)胞株HCT8/T和KB_(V200)中敲除uPAR后,腫瘤的增殖生長、遷移、侵襲能力減弱。而在低表達(dá)uPAR的腫瘤細(xì)胞AGS和H1299中過表達(dá)uPAR后,腫瘤的增殖生長、遷移、侵襲能力增強(qiáng)。4.在HCT8/T、KB_(V200)中敲除uPAR后:EGFR、HER3、β-Catenin、p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)、p-JNK(Thr183/Tyr185)、p-PTEN(Ser380)、BCL-XL、Snail的表達(dá)下降,相反在AGS、H1299中過表達(dá)uPAR后這些蛋白的表達(dá)卻上升。結(jié)論:uPAR蛋白在常見的腫瘤組織中高表達(dá),且在肺腺癌和腎透明細(xì)胞癌患者中uPAR的高表達(dá)與臨床預(yù)后不良有關(guān)。uPAR能促進(jìn)腫瘤多藥耐藥的發(fā)生和腫瘤的增殖生長、遷移、侵襲。另外,uPAR可能通過直接或者間接的影響表皮生長因子受體(EGFR)家族表達(dá)水平;Wnt/β-Catenin、MAPK信號通路;PTEN抑癌蛋白的磷酸化水平;抗凋亡信號通路;上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)途徑等來促進(jìn)腫瘤多藥耐藥的發(fā)生和腫瘤的增殖生長、遷移、侵襲。
【學(xué)位單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R73-3
【部分圖文】：

錨定附著所需的序列由外顯子 7 編碼。成熟的 uPAR 蛋白由 313 個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量 55KD—60KD，等電點(diǎn)為 4.5 左右[45]。只存在胞外結(jié)構(gòu)域，沒有跨膜區(qū)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，是通過糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨連接到細(xì)胞質(zhì)膜上，所以 uPAR 也是一種常見的糖蛋白，去掉糖基后其分子量大約為 35KD[46]。GPI 錨的形成是通過在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中不斷的組合切割附著而來，形成后替代 uPAR 蛋白的 COOH-末端部分，逐步使 uPAR 蛋白質(zhì)成熟。并且糖脂連接所需的兩個關(guān)鍵序列元件是 ser282-gly-283-ala284 和第306-313 位置的氨基酸序列[47]。uPAR 的氨基酸序列具有三個重復(fù)，每個重復(fù)約90 個氨基酸序列長度，表明存在三個同源獨(dú)立折疊的結(jié)構(gòu)域[48]。確實(shí)經(jīng)研究發(fā)現(xiàn) uPAR 含有由短連接子區(qū)連接的三個 Lu 結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域與淋巴細(xì)胞抗原6（Ly-6）蛋白超家族結(jié)構(gòu)域同源，被稱為 D1-D3 的 N-末端，也稱為三指折疊域（圖 1a）。通常 Lu 結(jié)構(gòu)域中富含半胱氨酸，導(dǎo)致 Lu 結(jié)構(gòu)域常由 4-5 個二硫鍵連接形成 5-6 個反平行 β-鏈折疊球狀結(jié)構(gòu)（圖 1b）[49, 50]。

34圖 3. uPAR 敲除腫瘤細(xì)胞株的構(gòu)建與鑒定Figure 3. The construction and identification of uPAR knockout tumor cell linesA：MTT 檢測到 HCT8/T 和 KBV200的嘌呤霉素（Puromycin）最小致死濃度分別為 100μg/ml 和 10μg/ml。B：WesternBlot 檢測構(gòu)建好的 HCT8/T 和 KBV200uPAR基因敲除株中 uPAR 的表達(dá)水平。C：設(shè)計(jì)好的鑒定 HCT8/T 和 KBV200uPAR 基

42圖 7. uPAR 能促進(jìn)腫瘤的增殖生長Figure 7.uPAR can promote tumor proliferationA：MTT 法檢測到在 HCT8/T 和 KBV200中敲除 uPAR 后，增殖生長減弱，相反在AGS、H1299 中過表達(dá) uPAR 后，增殖生長增強(qiáng)。B、C、D、E：SoftAgar 軟瓊脂 3D 培養(yǎng)法檢測到在 HCT8/T 和 KBV200中敲除 uPAR 后，增殖生長減弱，相反在 AGS、H1299 中過表達(dá) uPAR 后，增殖生長增強(qiáng)。（**代表 P<0.01，表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異）3.6 uPAR 能促進(jìn)腫瘤的遷移為了探究 uPAR 是否能對腫瘤的遷移產(chǎn)生影響，我們分別在 HCT8/T、KBV200中敲除 uPAR 和在 AGS、H1299 中過表達(dá) uPAR,然后采用劃痕法檢測改變 uPAR后對于腫瘤細(xì)胞遷移的影響情況。結(jié)果顯示，在 HCT8/T 和 KBV200中敲除 uPAR
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本文編號：2882819