結(jié)直腸癌是最常見的人類惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)。隨著手術(shù)、化療及靶向藥物聯(lián)合治療的綜合應(yīng)用,結(jié)直腸癌的生存率得到了一定程度的提高,但部分患者治療效果仍然不盡人意。因此,尋找結(jié)直腸癌治療特異性和靈敏性的靶點(diǎn),提高結(jié)直腸癌的治療效果是目前所面臨的難題。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)家族是一組跨膜糖蛋白,它具有酪氨酸激酶的活性,包括HER1(ERBB1/EGFR)、HER2(ERBB2)、HER3(ERBB3)、HER4(ERBB4)四個(gè)家族成員。HER4作為表皮生長因子受體家族的第4號(hào)成員,具有EGFR家族成員共同的結(jié)構(gòu)特征。有研究提示,HER4與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及不良的預(yù)后密切相關(guān)。?目前關(guān)于HER4在結(jié)直腸癌中表達(dá)的意義及HER4的預(yù)測(cè)價(jià)值方面的研究十分有限,而且存在爭(zhēng)議。因此需要更多的研究來明確HER4蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況及其與預(yù)后的關(guān)系。本研究通過應(yīng)用免疫組化檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中HER4表達(dá)情況及其臨床意義,構(gòu)建能夠靶向抑制HER4基因的慢病毒shRNA載體,并觀察其基因沉默的效果,建立沉默HER4基因的結(jié)腸癌細(xì)胞株。觀察HER4對(duì)結(jié)腸腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、黏附及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。第一部分HER4在結(jié)直腸癌中表達(dá)的臨床意義目的:檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中HER4蛋白的表達(dá)情況,探討HER4蛋白在結(jié)直腸癌中的臨床意義。方法:1采用免疫組化的方法檢測(cè)90例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中HER4蛋白的表達(dá)情況。2評(píng)價(jià)HER4蛋白的表達(dá)情況與臨床病理特征之間的關(guān)系;采用統(tǒng)計(jì)方法分析HER4蛋白與結(jié)直腸癌患者生存期之間的關(guān)系。結(jié)果:1.臨床病理特征經(jīng)過電話回訪了解90例結(jié)直腸癌患者的生存情況,其中73例患者成功得到生存資料,隨訪率為81.1%。73例隨訪成功的患者包括結(jié)腸癌28例,直腸癌45例;男性36例,女性37例;≤60歲38例,60歲35例;Ⅰ期+Ⅱ期41例,Ⅲ期32例;T_1期2例,T_2期14例,T_3期22例,T_4期35例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性41例,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性32例。隨訪過程有19人死亡,死亡原因均為術(shù)后腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,其中肺轉(zhuǎn)移11例,骨轉(zhuǎn)移4例,多發(fā)轉(zhuǎn)移5例,總生存率為73.97%。2.HER4在正常結(jié)直腸組織及癌組織中的表達(dá)情況HER4在正常結(jié)直腸組織中均為陰性表達(dá),在結(jié)直腸癌組織中陽性表達(dá)的為25例,陽性表達(dá)率34.2%,陽性表達(dá)主要定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中,表現(xiàn)為淺黃、棕黃及棕褐色不同強(qiáng)度的染色。HER4陰性表達(dá)的為48例,陰性表達(dá)率為65.8%。3.HER4與結(jié)直腸癌各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系HER4的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者的性別、年齡、腫瘤部位和分期均無顯著相關(guān)性(P0.05),與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性(P0.05)。淋巴結(jié)陽性的患者陽性率高于淋巴結(jié)陰性的患者(60.0%VS 40.0%,P=0.039)。4.HER4與結(jié)直腸癌患者5年生存率的關(guān)系HER4陽性的患者5年生存率為64.3%,HER4陰性的患者5年生存率為85.5%,兩者比較有顯著差異,HER4陽性患者的預(yù)后劣于HER4陰性的患者(P=0.020)。小結(jié):結(jié)直腸癌組織中的HER4陽性表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),HER4陽性患者的預(yù)后劣于HER4陰性的患者。第二部分HER4基因沉默結(jié)腸癌細(xì)胞株的建立目的:構(gòu)建針對(duì)人HER4基因的短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(shRNA)及其表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞,建立HER4基因沉默的結(jié)腸癌細(xì)胞株。方法:1通過基因查序獲得4條HER4基因的靶序列,連接到LV3慢病毒載體上,成功構(gòu)建攜帶HER4基因的慢病毒sh RNA載體。2包裝慢病毒,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,獲得高滴度的慢病毒濃縮液,對(duì)慢病毒濃縮液進(jìn)行病毒滴度的測(cè)定。3通過RT-PCR及Western Blot驗(yàn)證干擾效果,建立HER4基因沉默的結(jié)腸癌細(xì)胞株。結(jié)果:1.慢病毒載體的構(gòu)建HER4-shRNA1-4干擾載體經(jīng)測(cè)序,結(jié)果與HER4-shRNA1-4寡居單鏈正鏈序列完全一致,證明4條HER4基因干擾載體構(gòu)建成功。2.慢病毒滴度測(cè)定通過熒光顯微鏡結(jié)合稀釋倍數(shù)計(jì)算病毒滴度,測(cè)得4組慢病毒滴度分別為:HER4-shRNA1的感染滴度約為3×10~8TU/mLHER4-shRNA2的感染滴度約為1×10~8TU/mLHER4-shRNA3的感染滴度約為1×10~8TU/mLHER4-shRNA4的感染滴度約為2×10~8TU/mL3.慢病毒感染細(xì)胞情況當(dāng)慢病毒的感染滴度達(dá)到1×10~8TU/mL時(shí),按照1:5稀釋進(jìn)行感染,shHER4-1、shHER4-2、shHER4-3和shHER4-4四組病毒感染效率基本可達(dá)70%以上。4.ShRNA慢病毒對(duì)HCT116細(xì)胞HER4 mRNA表達(dá)的影響shHER4-1、shHER4-2、shHER4-3和shHER4-4組HER4 mRNA相對(duì)于H-ACTB的表達(dá)水平分別為1.18±0.22、3.77±0.55、1.17±0.15、0.54±0.01,與陰性對(duì)照組(1.13±0.13)及空白對(duì)照組(1.0±0.13)相比shHER4-4的mRNA表達(dá)水平明顯降低(P0.05)。5.ShRNA慢病毒對(duì)HCT116細(xì)胞HER4蛋白表達(dá)影響HCT116細(xì)胞、陰性對(duì)照細(xì)胞和shHER4-4組HER4蛋白表達(dá)水平灰度值分別為2070±50、1446±48、769±37,shHER4-4組HER4蛋白表達(dá)水平灰度值有明顯減弱(P0.05)。小結(jié):利用RNA干擾技術(shù)成功地建立了HER4基因沉默的結(jié)腸癌細(xì)胞株,為下一步實(shí)驗(yàn)提供了實(shí)驗(yàn)材料。第三部分HER4對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、黏附及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響目的:研究HER4對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡及及黏附的影響,探討HER4在結(jié)腸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用,為臨床通過調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌HER4蛋白水平抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移提供理論基礎(chǔ)。方法:1應(yīng)用MTT、流式細(xì)胞檢測(cè)法和細(xì)胞基質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)三組細(xì)胞的增殖、凋亡和黏附的情況。2應(yīng)用Western blot檢測(cè)三組細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)。3應(yīng)用免疫熒光雙染法檢測(cè)三組細(xì)胞E-cadherin和Vimentin的表達(dá)。結(jié)果:1.沉默HER4基因?qū)?xì)胞增殖的影響shRNA-HER4與空白對(duì)照及陰性對(duì)照組在24h、48h、72h相比較,OD值均明顯減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(shRNA-HER4組VS空白對(duì)照組:P0.05;shRNA-HER4組VS陰性對(duì)照組:P0.05)。2.沉默HER4基因?qū)?xì)胞凋亡的影響shRNA-HER4、空白對(duì)照及陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為(3.43±0.67)%、(0.76±0.33)%、(0.9±0.35)%。shRNA-HER4組與空白對(duì)照及陰性對(duì)照組相比較凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(shRNA-HER4組VS空白對(duì)照組:P0.05;shRNA-HER4組VS陰性對(duì)照組:P0.05)。3.沉默HER4基因?qū)?xì)胞基質(zhì)黏附的影響。shRNA-HER4組細(xì)胞黏附的數(shù)量較空白對(duì)照和陰性對(duì)照組顯著增加(P0.05)。shRNA-HER4組OD值在1h和2h較空白對(duì)照和陰性對(duì)照組顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(shRNA-HER4組VS空白對(duì)照組:P0.05;shRNA-HER4組VS陰性對(duì)照組:P0.05)。4.Western blot檢測(cè)沉默HER4基因?qū)?xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。shRNA-HER4組細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)較空白對(duì)照和陰性對(duì)照組顯著上調(diào)(P0.05),而間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin的表達(dá)水平較空白對(duì)照和陰性對(duì)照組顯著下調(diào)(P0.05)5.免疫熒光雙染法檢測(cè)E-cadherin和Vimentin的表達(dá)shRNA-HER4、空白對(duì)照和陰性對(duì)照組三組細(xì)胞比較shRNA-HER4組細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-cadherin較空白對(duì)照和陰性對(duì)照組顯著增多(P0.05),而間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin較空白對(duì)照和陰性對(duì)照組顯著較少(P0.05)。小結(jié):HER4不僅促進(jìn)細(xì)胞增殖抑制凋亡,還可以促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,進(jìn)而減少結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞黏附性促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。結(jié)論:1.結(jié)直腸癌組織中的HER4陽性表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),HER4陽性患者的預(yù)后劣于HER4陰性的患者。2.利用RNA干擾技術(shù)成功地建立了HER4基因沉默的結(jié)腸癌細(xì)胞株,為下一步實(shí)驗(yàn)提供了實(shí)驗(yàn)材料。3.HER4不僅促進(jìn)細(xì)胞增殖抑制凋亡,還可以促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,進(jìn)而減少結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞黏附性促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.34
【部分圖文】：

圖 1 HER4 在正常結(jié)直腸組織中陰性表達(dá)(SP 法)Fig.1 HER4 negative expression in colorectal tissuesbar=20μm(×200).

圖 1 HER4 在正常結(jié)直腸組織中陰性表達(dá)(SP 法)Fig.1 HER4 negative expression in colorectal tissuesbar=20μm(×200).

21圖 4 HER4 陽性表達(dá)和陰性表達(dá)組的生存曲線的比較Fig.4 The association of 5-year survival with HER4.The prognosis of HER4 positive patients was inferior to that of HER4negative (P =0.020).
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