結(jié)直腸癌是消化道常見腫瘤,近年來發(fā)病率有上升趨勢(shì)。雖然糞隱血實(shí)驗(yàn)、結(jié)腸鏡檢等檢查提高了結(jié)直腸癌的診斷率,但是,非侵入性的液體活檢技術(shù)仍是早期發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌、降低結(jié)直腸癌相關(guān)死亡率的預(yù)期診斷策略。目前大多數(shù)篩查方法都不足以取代傳統(tǒng)的結(jié)直腸癌診斷方法(直腸指診、影像學(xué)檢查、結(jié)腸鏡檢查、病理檢查),且癌胚抗原(CEA)作為疾病診斷標(biāo)志物,對(duì)早期腫瘤的診斷價(jià)值不大。隨著技術(shù)的進(jìn)步及對(duì)癌癥相關(guān)分子的深入研究,外泌體被認(rèn)為是一種潛在的新型生物標(biāo)志物。外泌體是一種直徑30-200 nm的微囊泡,細(xì)胞通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)傳遞、胞吐等過程將外泌體釋放到外周血、尿液、唾液、組織液等體液中。外泌體因其囊泡樣結(jié)構(gòu)攜帶大量生物分子,其中包括能夠反映和代表宿主細(xì)胞來源的核酸和蛋白質(zhì)。而且,癌細(xì)胞釋放出的外泌體具有特異性的遺傳信息和表觀遺傳修飾,使其在信號(hào)傳遞、腫瘤轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用。結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞在分泌外泌體的過程中,在外泌體表面、囊泡內(nèi)都組裝了結(jié)直腸癌細(xì)胞特異性的分子,如A33(vaccinia virus antigen)、上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)、CEA等。從臨床檢測(cè)角度分析,攜帶有腫瘤特異性分子的外泌體,因其廣泛分布于各種體液中,因此可以作為液體活檢的新型檢測(cè)標(biāo)志物,應(yīng)用于非侵入性的臨床診斷操作。但是外泌體為納米級(jí)結(jié)構(gòu),且腫瘤早期其在外周血中的數(shù)量相對(duì)較少,現(xiàn)有的常規(guī)臨床檢測(cè)方法很難對(duì)外泌體進(jìn)行分離、富集和精確的定量檢測(cè),因此,建立快速、靈敏的外泌體檢測(cè)方法是目前的研究需要。(一)新型納米材料在微量檢測(cè)中的應(yīng)用越來越廣,其中氧化石墨烯因其良好的生物相容性、比表面積大等特性,已被大量用于生物分子、活細(xì)胞檢測(cè)。適配體是寡核苷酸單鏈,能夠特異性地與檢測(cè)目標(biāo)(包括小分子化合物、蛋白、活細(xì)胞及外泌體等)結(jié)合,具有親和力高、特異性強(qiáng)、可對(duì)其進(jìn)行多種化學(xué)修飾等優(yōu)點(diǎn),氧化石墨烯能夠與適配體通過分子間相互作用力結(jié)合,從而引起相關(guān)化學(xué)特性的改變。目前已有多項(xiàng)研究利用GO及適配體進(jìn)行小分子化合物及活細(xì)胞的檢測(cè)。但是,氧化石墨烯與熒光DNA單鏈適配體相互作用的方法在外泌體檢測(cè)中還未有報(bào)道。本文在第一部分建立了一個(gè)基于氧化石墨烯與熒光DNA單鏈適配體相互作用的結(jié)直腸癌外泌體快速熒光檢測(cè)方法,以結(jié)直腸癌外泌體特異性蛋白CD63和EpCAM為聯(lián)合檢測(cè)靶點(diǎn),該體系利用熒光DNA單鏈適配體-GO復(fù)合體為探針,在與結(jié)直腸癌外泌體相互作用的過程中,復(fù)合體發(fā)生構(gòu)象變化,GO對(duì)熒光DNA單鏈適配體的吸附和解離導(dǎo)致熒光猝滅和熒光恢復(fù),通過熒光強(qiáng)度變化可對(duì)結(jié)直腸癌外泌體進(jìn)行定量檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)過程中我們對(duì)反應(yīng)條件及體系進(jìn)行了優(yōu)化,并以脫氧核糖核酸酶為工具酶,對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行放大,最終得到對(duì)結(jié)直腸癌外泌體檢測(cè)靈敏度達(dá)到2.1×10~4 particles/ml的檢測(cè)方法,該檢測(cè)可在30分鐘內(nèi)完成。用19例臨床血清樣本(5ml)對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證,其可有效區(qū)分健康對(duì)照和結(jié)直腸癌患者(P0.05),證明該方法在臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。但是,該檢測(cè)體系選擇的檢測(cè)靶點(diǎn)為EpCAM,EpCAM在胰腺癌、乳腺癌等腫瘤外泌體中也過量表達(dá),因此該方法的特異性有待進(jìn)一步提高。在下一步研究中,本課題將針對(duì)檢測(cè)的特異性及靈敏度進(jìn)行改進(jìn)。(二)質(zhì)譜檢測(cè)具有靈敏度高、檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍廣、特異性強(qiáng)等特性,目前已被廣泛應(yīng)用于疾病診斷、微生物檢測(cè)、藥物分析等領(lǐng)域。為簡(jiǎn)化質(zhì)譜檢測(cè)方法,一些新型的常壓電離方法已被開發(fā)出來,如紙噴霧電離技術(shù)。紙噴霧電離質(zhì)譜檢測(cè)具有高效、簡(jiǎn)便、無需對(duì)樣品進(jìn)行前處理等優(yōu)點(diǎn),但是在對(duì)生物樣本進(jìn)行檢測(cè)時(shí),因無樣本前處理步驟,而生物樣本內(nèi)容物復(fù)雜,其他離子或蛋白質(zhì)等分子會(huì)抑制待測(cè)物的信號(hào),導(dǎo)致靈敏度較差。生物大分子因其分子量大,直接進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí)所得數(shù)據(jù)量大,不易分析。若在生物大分子上標(biāo)記反應(yīng)可逆的小分子化合物,通過檢測(cè)小分子化合物間接對(duì)生物大分子進(jìn)行定量分析,可極大提高檢測(cè)效果。為進(jìn)一步提高結(jié)直腸癌外泌體的檢測(cè)靈敏度,本文在第二部分建立了一種基于免疫反應(yīng)的接觸式紙噴霧離子化質(zhì)譜檢測(cè)方法,用于檢測(cè)樣品中的結(jié)直腸癌外泌體。該方法構(gòu)建了一個(gè)雙層紙芯片用于樣品前處理,用免疫方法對(duì)外泌體進(jìn)行捕獲,捕獲抗體為抗CD63抗體,從而實(shí)現(xiàn)外泌體的純化與富集;并且構(gòu)建了兩種可裂解的小分子離子探針(DMG-probe,DPA-probe),用離子探針對(duì)外泌體特異性檢測(cè)抗體抗A33抗體進(jìn)行標(biāo)記,離子探針被裂解后進(jìn)入質(zhì)譜儀完成檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)利用紙芯片實(shí)現(xiàn)了免疫反應(yīng)與紙噴霧檢測(cè)小分子離子探針的集成分析,DMG-probe和DPA-probe對(duì)結(jié)直腸癌外泌體的最低檢測(cè)濃度分別為1.7×10~2 particles/ml和2.5×10~2 particles/ml,其靈敏度是第一部分氧化石墨烯方法的100倍。而且,該紙芯片可對(duì)捕獲的外泌體樣本進(jìn)行長(zhǎng)期有效保存(30天),因此可用于患者自助式分析,即患者在家中或其他場(chǎng)所完成紙芯片上的免疫反應(yīng),然后將紙芯片送至質(zhì)譜檢測(cè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)。本文分別利用新型納米材料和紙噴霧離子化質(zhì)譜方法建立了兩種結(jié)直腸癌外泌體快速檢測(cè)平臺(tái),兩種方法均具有快速、方便、高靈敏度的特點(diǎn),在腫瘤外泌體的臨床診斷中具有很大的應(yīng)用前景。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.34;R730.43
【部分圖文】：

對(duì)結(jié)直腸癌外泌體進(jìn)行雙靶點(diǎn)聯(lián)合檢測(cè)，所選檢測(cè)目標(biāo)為 CD63 和 EpCAM，CD63 是一種膜蛋白，是外泌體標(biāo)志性蛋白；EpCAM 是一種跨膜糖蛋白，在上皮細(xì)胞中介導(dǎo) Ca2+非依賴性同型細(xì)胞黏附，多個(gè)結(jié)直腸癌外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)研究證實(shí)EpCAM 是結(jié)直腸腫瘤組織來源外泌體的特異性蛋白。且 CD63 及 EpCAM 蛋白對(duì)應(yīng)的高特異性高親和力的適配體均已被篩選出來[28][29][30]。在該檢測(cè)系統(tǒng)中，分別用不同的熒光染料對(duì) CD63 適配體及 EpCAM 適配體進(jìn)行修飾，并用適當(dāng)濃度的 GO 水溶液使適配體熒光淬滅。加入結(jié)直腸癌外泌體后，CD63 適配體及 EpCAM 適配體從GO 上解離并與外泌體表面上的目的蛋白結(jié)合，從而使兩種熒光同時(shí)恢復(fù)。在此過程中，DNase I 可剪切與外泌體蛋白結(jié)合的單鏈 DNA 適配體，將外泌體釋放到體系中繼續(xù)與 GO 上的適配體結(jié)合，從而達(dá)到熒光信號(hào)增強(qiáng)的效果。GO 對(duì)其結(jié)合的核酸適配體具有保護(hù)作用，DNase I 不能水解 GO 上的適配體，只能水解與外泌體蛋白結(jié)合的適配體，從而保證了檢測(cè)的有效性。具體檢測(cè)流程見圖 1。該部分課題首先以結(jié)直腸癌細(xì)胞系（SW480）外泌體為檢測(cè)目標(biāo)，以驗(yàn)證可方法的可行性，并對(duì) GO 濃度、適配體熒光淬滅時(shí)間、DNase I 酶反應(yīng)時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化，以獲得經(jīng)濟(jì)、快速、靈敏的檢測(cè)體系。體系優(yōu)化后，對(duì)結(jié)直腸癌患者血清進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證其臨床檢測(cè)能力。

系統(tǒng)檢測(cè)各血清樣品，并與臨床 CEA 結(jié)果進(jìn)行對(duì)照，比較該系統(tǒng)的檢測(cè)陽性率。3.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用 SPSS 22.0 for windows 和 Origin 8.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，三組以上組間比較用LSD-t 檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布（Shapiro-Wilk 檢驗(yàn) P>0.1）及方差齊性（P>0.05）；結(jié)腸癌患者與健康對(duì)照間比較用兩個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù) Mann-Whitney 檢驗(yàn)。LSD-t 檢驗(yàn)與 M-W 檢驗(yàn)水準(zhǔn)均為 α=0.05，Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)水準(zhǔn)為 α=0.1。四、結(jié)果4.1 外泌體特征及定量檢測(cè)。用場(chǎng)發(fā)射透射電鏡對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系外泌體進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，鏡下觀察到典型的外泌體膜結(jié)構(gòu)（圖 2-A），直徑~50 nm，大小與文獻(xiàn)中報(bào)道的外泌體大小相似；用 NTA對(duì)細(xì)胞系外泌體大小進(jìn)行跟蹤后顯示，外泌體濃度為 3×1010particles/ml，其粒徑主要分布在 105nm 左右（圖 2-B）。用 BCA 法對(duì)外泌體總蛋白濃度進(jìn)行定量檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果總蛋白量為 1600 g/ml。

醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文4.2 氧化石墨烯最優(yōu)淬滅濃度為 0.1 mg/ml。將 GO 濃度設(shè)定為 0，0.05，0.1，0.15，0.2，0.4，0.6，0.8 mg/ml，與熒光D63-Aptamer-Cy3 和 EpCAM-Aptamer-FAM 共孵育后測(cè)定兩種熒光染料的熒從圖 3 中可看出，當(dāng) GO 濃度達(dá)到 0.1 mg/ml 時(shí)，F(xiàn)AM 熒光已被完全淬滅與 FAM 結(jié)果相同。為保證適配體熒光有效淬滅及恢復(fù)，將體系中的 GO 濃 0.1 mg/ml。
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