乳腺癌是目前嚴重危害女性健康的惡性腫瘤之一,術(shù)后轉(zhuǎn)移是其較難治愈的主要原因。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-2與Nck互作的絲氨酸蛋白激酶(TNIK)是一種多效能的腫瘤靶蛋白,在乳腺癌組織中異常高度表達,TNIK可參與激活Wnt/β-catenin通路,對于乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。藥根堿屬于原小檗堿型異喹啉類生物堿,該類生物堿對多種癌細胞均具有較強的細胞毒性作用。通過藥物分子模擬對接顯示TNIK可能是藥根堿作用癌細胞的靶標抑制蛋白。因此解析TNIK調(diào)控乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機制,探尋抑制乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的靶向藥物,對于乳腺癌的治療具有重要的意義。本研究利用基因編輯CRISPR/Cas9技術(shù)靶向敲除TNIK,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的癌細胞株MDA-MB-231/TNIK-KO及MDA-MB-231/TNIK-Control,通過免疫熒光及免疫印跡檢測TNIK敲除后癌細胞內(nèi)TNIK、p-TNIK及Wnt/β-catenin通路關(guān)鍵蛋白表達情況,從而證明敲除TNIK可調(diào)控Wnt/β-catenin通路關(guān)鍵蛋白表達及逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),影響癌細胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力,且其效果可通過加入藥根堿處理加強。同同時藥根堿可顯著抑制敲除細胞的生長增殖,誘導細胞發(fā)生凋亡。MTT、流式、免疫熒光及Western Blot實驗結(jié)果表明藥根堿對乳腺癌細胞MDA-MB-231及MCF-7具有明顯的毒性作用,能夠抑制其生長,調(diào)控細胞的生長周期,誘導細胞線粒體膜電位發(fā)生改變,從而發(fā)生早期凋亡。再通過克隆形成、劃痕愈合、免疫熒光及Western Blot實驗證明藥根堿能夠破壞細胞膜骨架蛋白F-actin,調(diào)控TNIK蛋白表達破壞乳腺癌細胞的完整性,從而降低癌細胞的運動遷移能力。對于Wnt信號通路,藥根堿能夠調(diào)控關(guān)鍵蛋白β-catenin的表達使其下調(diào),上調(diào)表達GSK-3β蛋白,并調(diào)控EMT上皮樣E-cadherin蛋白表達顯著增加,而間質(zhì)樣N-cadherin蛋白表達呈降低趨勢,從而逆轉(zhuǎn)EMT。此外,藥根堿還能夠逆轉(zhuǎn)MCF-7/DOX細胞對化療藥物阿霉素的耐藥性,并調(diào)控相關(guān)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)錄。以上結(jié)果在體內(nèi)實驗中得到進一步證實,藥根堿能夠明顯抑制乳腺腫瘤組織的生長和轉(zhuǎn)移,且對荷瘤小鼠無明顯毒性。綜上所述,藥根堿對乳腺癌細胞的生長增殖都具有顯著的調(diào)節(jié)作用,可以改變細胞遷移能力,阻滯細胞周期,最終引發(fā)細胞凋亡。而且藥根堿能夠靶向腫瘤蛋白TNIK,調(diào)控Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達,進一步逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞發(fā)生EMT。本課題的研究,可以為藥根堿的抗腫瘤活性及抑制轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)研究提供實驗基礎(chǔ),同時藥根堿作為一種極有前景的新型TNIK抑制劑,有望應用于乳腺癌的靶向藥物治療。
【學位單位】：浙江理工大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R737.9
【部分圖文】：

小分子結(jié)構(gòu)藥物，針對乳腺癌組織中對應的結(jié)構(gòu)分子或相關(guān)蛋白質(zhì)，與其結(jié)合，從而調(diào)控癌細胞的生長失控與遠處遷移。由于這些特定的小分子靶向藥物只在腫瘤細胞中表達，因此靶向治療的藥物的毒性要遠遠小于化療藥物，具有良好的應用前景。1.2 TNIK 促進癌癥侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制及其抑制劑TNIK（Traf-2 and Nck interacting kinase）是由腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-2與 Nck 互作的絲氨酸蛋白激酶，1999 年被首次發(fā)現(xiàn)，由于在乳腺癌等實體癌組織中異常高度表達而引起廣泛關(guān)注[25-27]。TNIK 編碼含 1360 個氨基酸多肽鏈，其結(jié)構(gòu)由 N 端激酶結(jié)構(gòu)域、中間結(jié)構(gòu)域和 C 端生發(fā)中心激酶結(jié)構(gòu)域組成（圖 1.1）。已發(fā)表文獻證實 TNIK 是一種多效能的細胞因子，可通過 Wnt/β-catenin 通路對細胞的生長產(chǎn)生影響，與癌細胞增殖、EMT、細胞骨架構(gòu)建及凋亡等生物學活性緊密相連[28-30]。Germinal center

浙江理工大學碩士學位論文 藥根堿靶向腫瘤蛋白 TNIK 抑制乳腺癌生長轉(zhuǎn)移機制研究Twist 結(jié)合 E-cadherin，結(jié)合盒啟動子區(qū)的啟動可抑制 E-cadherin mRNA 的轉(zhuǎn)錄，降低胞內(nèi) E-cadherin，同時高表達 N-cadherin，介導上皮細胞變得松散不易相連，改變極性，完成到間質(zhì)的轉(zhuǎn)變�；谝陨蠄蟮�，可推斷 TNIK 通過 Wnt/β-catenin 通路調(diào)控 EMT 促進乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用機制為：TNIK 通過自身磷酸化破壞細胞膜骨架蛋白，導致膜上的 F-actin/E-cadherin/β-catenin 復合體解體，細胞骨架形態(tài)改變，黏附性下降；另一方面復合體的解構(gòu)，使信號分子多分散在胞漿內(nèi)，靶向 Wnt 信號通路基因，一部分信號分子通過核膜進一步調(diào)控結(jié)合 LEF/TCF4 轉(zhuǎn)錄因子，致使相關(guān)基因串聯(lián)啟動，發(fā)生 EMT，從而促進乳腺癌細胞的浸潤轉(zhuǎn)移（圖 1.2）。因此，細胞膜骨架上的 TNIK 分子被磷酸化，可能是促進其異常激活 Wnt/β-catenin 通路誘導乳腺癌細胞發(fā)生 EMT 并侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，此機制將在本研究中進一步得到證實。

圖 1.3 藥根堿與 TNIK 晶體結(jié)構(gòu)的分子模擬模型Figure 1.3 Docked modeling of jatrorrhizine was performed using a TNIK crystal structure1.4 實驗目的和意義乳腺癌作為危害女性健康的主要惡性腫瘤，術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移的特性也成為其難以治愈的難題之一。最新研究表明 TNIK 在乳腺癌等實體癌組織中異常高度表達，可激活 Wnt/β-catenin 通路，對于癌癥的侵襲轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。前期研究已發(fā)
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 ;High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells[J];Science Foundation in China;2014年02期

2 嚴婷;張蓮芬;張熔熔;馮磊;金堅;;人乳腺癌多藥耐藥細胞系MCF-7/MDR~a的建立及其生物學特性的初步研究[J];細胞生物學雜志;2006年04期

本文編號：2861574