研究背景和目的：肺癌是世界上發(fā)病率及死亡率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤,并且繼續(xù)在上升,在中國(guó)和在大多數(shù)工業(yè)化國(guó)家中,肺癌已居各類(lèi)惡性腫瘤死因的第一位。肺癌的產(chǎn)生是環(huán)境-遺傳因素共同作用所致,但具體的發(fā)病機(jī)制還沒(méi)有徹底明晰,但流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示在環(huán)境危險(xiǎn)因素中,吸煙與肺癌發(fā)生發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系最密切,吸煙者罹患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)是非吸煙者的20倍,肺癌患者中80%以上與煙草依賴(lài)或成癮行為有關(guān)。與此同時(shí),另外一種現(xiàn)象值得我們注意,就是吸煙者中卻僅有10%～15%會(huì)發(fā)生肺癌。這表明個(gè)體對(duì)肺癌的易感性存在差異,而導(dǎo)致這種差異的原因來(lái)源于遺傳的多態(tài)性。對(duì)于研究復(fù)雜性疾病的遺傳易感性比如肺癌,全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-wide association studies, GWAS)是一種有效的手段,為研究者打開(kāi)了一扇通往研究復(fù)雜疾病的大門(mén)。GWAS是在研究的目標(biāo)人群中設(shè)病例組和對(duì)照組,使用單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism, SNP)作為兩組關(guān)聯(lián)分析的遺傳標(biāo)記,對(duì)照分析兩組間的全基因組差別,進(jìn)而有希望發(fā)現(xiàn)影響疾病發(fā)生的遺傳特征。如果病例組較對(duì)照組相比,病例組中出現(xiàn)了某個(gè)SNP位點(diǎn)的等位基因或基因型出現(xiàn)的頻率顯著改變,則認(rèn)為SNP位點(diǎn)可能與疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān),最后,研究者通過(guò)基因定位和連鎖不平衡分析確定疾病可能的易感基因。目前在全世界范圍內(nèi)進(jìn)行的GWAS已經(jīng)為肺癌篩選出一批遺傳易感性相關(guān)的常見(jiàn)基因變異,例如尼古丁乙酰膽堿受體和CYP2A6功能相關(guān)的基因變異位點(diǎn),這些位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性可增加或降低個(gè)體罹患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)。以上研究結(jié)果提示通過(guò)檢測(cè)與罹患肺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的遺傳學(xué)分子標(biāo)志,有助于進(jìn)行肺癌病因?qū)W研究及篩選肺癌高危人群。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是指基因組DNA中由于某個(gè)單個(gè)核苷酸發(fā)生轉(zhuǎn)換、顛倒、插入或缺失等變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP在人類(lèi)基因組中具有數(shù)量眾多、分布廣泛和穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn),SNP可能發(fā)生在基因的編碼序列上,亦可發(fā)生在非編碼序列上。根據(jù)SNP在基因中的不同位置,可分為基因調(diào)控區(qū)單核苷酸多態(tài)性(Regulatory SNP,rSNP)和基因編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性(Coding SNP, cSNP)。根據(jù)基因編碼區(qū)SNP是否改變編碼的氨基酸序列,cSNP又可分為同義cSNP (Synonymous cSNP)和非同義cSNP (Non-synonymous cSNP)。同義cSNP指堿基序列的改變并不引起蛋白質(zhì)的氨基酸序列變化；非同義cSNP的變異可以改變編碼的氨基酸殘基的種類(lèi),進(jìn)而引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的變化。另外,rSNP則可以通過(guò)影響與轉(zhuǎn)錄因子或miRNA的結(jié)合,引起基因表達(dá)水平的改變或mRNA的穩(wěn)定性及翻譯過(guò)程的變化,進(jìn)而影響細(xì)胞正常功能�？偟膩�(lái)說(shuō),這些潛在功能性SNPs通常會(huì)被優(yōu)選用來(lái)探討與疾病發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系,進(jìn)而為包括肺癌在內(nèi)的惡性腫瘤的防治及臨床治療策略提供科學(xué)依據(jù)。SNP與肺癌易感性關(guān)系的研究是目前肺癌研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn),并且在世界多個(gè)地區(qū)進(jìn)行的GWAS已經(jīng)尋找到一些影響肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的易感基因位點(diǎn)和染色體區(qū)域。例如,尼古丁基因家族成員CHRNA3、CHRNB4、CHRNB2 (cholinergic receptor, nicotinic, α3,β4 and β2)可編碼煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptors, nAChRs),與個(gè)體的吸煙行為有關(guān)。過(guò)去研究認(rèn)為nAChRs僅存在于神經(jīng)系統(tǒng),但是最近研究已證實(shí),nAChRs也分布在肺支氣管上皮細(xì)胞上,而且在肺癌的產(chǎn)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用。煙堿型乙酰膽堿受體屬于配體門(mén)控離子通道超家族,可被乙酰膽堿、膽堿和尼古丁激活,參與尼古丁和煙草亞硝胺的調(diào)節(jié),而尼古丁和煙草亞硝胺正是吸煙相關(guān)肺癌的主要致癌物。此外,尼古丁與細(xì)胞表面的nAChRs受體蛋白結(jié)合,通過(guò)多種途徑影響腫瘤的進(jìn)展,如細(xì)胞增殖、侵襲和間質(zhì)血管的生成,同時(shí)還能保護(hù)腫瘤細(xì)胞逃避程序性死亡,發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。CHRNA3基因編碼的乙酰膽堿α3亞基蛋白能結(jié)合煙草專(zhuān)有的致癌物NNK,導(dǎo)致癌基因的激活,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖,增加機(jī)體罹患肺癌風(fēng)險(xiǎn)。此外,別的致癌物質(zhì)如亞硝胺作用于nAChRs蛋白后,能促進(jìn)腫瘤血管和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。來(lái)自冰島、法國(guó)、美國(guó)和英國(guó)的獨(dú)立GWAS結(jié)果亦證實(shí)遺傳易感性與肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系密切。四組研究人員通過(guò)對(duì)肺癌患者和健康人群的病例-對(duì)照分析,均驗(yàn)證了染色體15q24-25區(qū)域編碼：nAChR:基因家族的多個(gè)SNPs位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的影響作用。然而,在韓國(guó)、日本及中國(guó)人群中的研究卻未能重復(fù)該實(shí)驗(yàn)結(jié)果,其原因可能是因?yàn)檫@些多態(tài)性位點(diǎn)的最小等位基因頻率(Minor Allele Frequency,MAF)分布在亞洲人群中較低。以上的研究結(jié)果提示肺癌的易感基因位點(diǎn)的分布存在著種族和地域的不同。因此,在我國(guó)人群中進(jìn)行基因多態(tài)性與肺癌發(fā)病關(guān)聯(lián)的研究是非常有必要的,我們可以從中尋找出中國(guó)人群的肺癌易感位點(diǎn),為我國(guó)肺癌高危人群的篩查以及個(gè)體化預(yù)防和治療奠定數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。位于染色體1q21區(qū)域的CHRNB2 (cholinergic receptor nicotinicβ2)基因、位于15q25.1區(qū)域的CHRNA3基因和CHRNB4基因(cholinergic receptor nicotinic α3 and β4)及位于20q13.2區(qū)域的基因CHRNA4(cholinergic receptor nicotinic α4。以上基因編碼的煙堿乙酰膽堿受體(nAChRs)可能會(huì)影響個(gè)體吸煙行為和煙草成癮性,也涉及煙草致癌物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控,可以抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤增殖,與肺癌的發(fā)生關(guān)系密切。盡管在歐美及亞洲人群中均有該基因家族的變異位點(diǎn)與肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)的報(bào)道,但產(chǎn)生該關(guān)聯(lián)的機(jī)制是直接作用于癌變的分子通路還是通過(guò)影響吸煙行為間接作用于癌變的分子通路,亦或是二者的協(xié)同作用所致,目前尚無(wú)定論。尼古丁受體基因家族的位點(diǎn)發(fā)生突變,結(jié)果可能增加個(gè)體的吸煙量,故研究人員認(rèn)為,基因多態(tài)性影響吸煙行為,從而提高機(jī)體肺癌產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)。例如日本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)1q21區(qū)域的rs4845652 T等位基因攜帶者有較低的尼古丁依賴(lài)性(nicotine dependence,Nd),同時(shí)證明了CHRNA4、CHRNB2基因與基因的相互作用影響Nd,比如那些同時(shí)攜帶有CHRNA4rs1044397 GG或GA基因型和CHRNB2 CC基因型的吸煙者Nd較高。另外冰島的GWAS研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)染色體15q24-25區(qū)域上rs1051730位點(diǎn)的遺傳變異與煙草成癮行為有關(guān),可導(dǎo)致個(gè)體的吸煙量及罹患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加。然而,歐美學(xué)者進(jìn)行的GWAS卻得出了不同的結(jié)論,其研究結(jié)果表明染色體15q25區(qū)域rs1051730和rs8034191位點(diǎn)的多態(tài)性變化與吸煙量及Nd無(wú)關(guān)。CYP2A6基因位于人類(lèi)19號(hào)染色體長(zhǎng)臂的19q12-19q13.2區(qū)域,超過(guò)6000個(gè)堿基對(duì),包含9個(gè)外顯子,編碼494個(gè)氨基酸,其編碼香豆素7-羥化酶,在生理過(guò)程藥物代謝及毒物代謝中發(fā)揮著重要的作用,特別是在外源性化學(xué)物質(zhì)的代謝中,參與許多前致癌物的代謝活化,例如黃曲霉毒素B1,亞硝胺,1,3-丁二烯等。CYP2A6是表達(dá)在人類(lèi)呼吸道中的P450酶,負(fù)責(zé)將煙草中大量的致癌物質(zhì)如NNK、NNAL、NNN等強(qiáng)致癌物活化,而NNK是TSNA中最強(qiáng)的一種致癌物,也是煙草中含量最多的肺致癌物,對(duì)肺組織有高度的親和性,被認(rèn)為是煙草中可能引起肺癌重要成分之一。CYP2A6可能以缺失和重復(fù)基因的形式存在,另外它還包含了基因轉(zhuǎn)換、核苷酸缺失、核苷酸插入以及單核苷酸多態(tài)性(SNP)的形式。根據(jù)CYP2A6對(duì)其特異底物的代謝能力不同,分為強(qiáng)代謝個(gè)體(EMs)和弱代謝(PMs)個(gè)體。影響CYP2A6活性一個(gè)重要因素就是其的基因多態(tài)性,目前有近30種的CYP2A6基因突變被發(fā)現(xiàn),CYP2A6*1是野生型純合子。CYP2A6*2是L160H的突變,被認(rèn)為是導(dǎo)致歐洲人群弱代謝個(gè)體的主要突變。CYP2A6*3是基因轉(zhuǎn)位引起的變異,而CYP2A6*4是基因3非編碼區(qū)域的缺失引起的變異,也被認(rèn)為是導(dǎo)致亞洲人群中弱代謝個(gè)體的主要突變類(lèi)型,頻率高達(dá)15%-20%,我國(guó)研究者在CYP2A6表型的研究中就發(fā)現(xiàn)中國(guó)人群PMs頻率高達(dá)13.3%,與CYP2A6*4在亞洲人群高頻率突變有一定關(guān)系。CYP2A6等位基因頻率在不同種族之間的分布存在很大差別,大多數(shù)等位基因在亞洲人群中的頻率較高。另外,根據(jù)CYP2A6基因型把CYP2A6對(duì)尼古丁的代謝能力分為正常代謝(normal,100%)、中間代謝(intermediate,75%左右)、慢代謝(slow,50%-25%)、低代謝(poor,25%)四組。目前在不同種族進(jìn)行關(guān)于CYP2A6和肺癌易感性的研究,出現(xiàn)的不一致甚至矛盾的結(jié)果。基于以上研究結(jié)果的不一致性,有必要在不同種族及不同吸煙狀態(tài)的人群中對(duì)基因多態(tài)性與肺癌發(fā)病的關(guān)聯(lián)進(jìn)行驗(yàn)證,并探討遺傳風(fēng)險(xiǎn)和其他環(huán)境因素對(duì)易感基因功能的可能影響。目前,雖然肺癌的易感基因研究已取得很大進(jìn)展,但大部分?jǐn)?shù)據(jù)是以西方人群為基礎(chǔ),有關(guān)中國(guó)漢族人群的研究數(shù)據(jù)仍十分缺乏,因此針對(duì)中國(guó)人群肺癌的病因?qū)W研究尤為重要。本課題旨在通過(guò)病例-對(duì)照分析,探討染色體nAChR基因SNP和CYP2A6基因多態(tài)性與中國(guó)南方男性肺癌發(fā)病的相關(guān)性,從而為肺癌高危人群的篩查、早期診斷和個(gè)體化治療提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)將研究對(duì)象限定在中國(guó)南方男性肺癌患者,挑選出了5個(gè)肺癌可能易感的尼古丁乙酰膽堿受體SNP位點(diǎn),同時(shí)選擇了CYP2A6五個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)。利用iMLDR技術(shù)在中國(guó)南方肺癌患者和健康對(duì)照者中進(jìn)行mAChR基因多態(tài)性分型；同時(shí)采用多重LONG-PCR電泳與SNaPshot相結(jié)合的方法對(duì)CYP2A6進(jìn)行基因多態(tài)性檢測(cè)并整理檢測(cè)結(jié)果,利用SPSS13.0軟件進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析。探討各個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性分布與肺癌患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系,驗(yàn)證中國(guó)南方男性肺癌易感SNP位點(diǎn)。綜合以上數(shù)據(jù)為中國(guó)南方男性肺癌高危人群的確定及個(gè)體化預(yù)防和治療奠定初步的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和理論依據(jù),也為下一步建立適合中國(guó)南方男性的肺癌易感基因風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型做準(zhǔn)備。研究方法：1.研究對(duì)象病例組來(lái)源于2013年5月至10月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院收集的經(jīng)病理證實(shí)為肺癌的204例患者。對(duì)照組為來(lái)自同期體檢中心無(wú)腫瘤病史及相關(guān)肺疾病的健康人群821例。研究對(duì)象均來(lái)源于中國(guó)南方男性,采集所有研究對(duì)象外周血樣本。2.SNP位點(diǎn)的挑選從NCBI的SNP信息數(shù)據(jù)庫(kù)、全基因組關(guān)聯(lián)分析以及其它國(guó)內(nèi)外大樣本研究得到的陽(yáng)性位點(diǎn)中挑選出了5個(gè)肺癌可能易感的尼古丁乙酰膽堿受體SNP位點(diǎn),具體為：位于CHRNA3基因的rs6495308；位于CHRNB4基因的rs11072768；位于CHRNA4基因的rs3787140及位于CHRNB2基因的rs2072659和rs2072660；同時(shí)選擇了CYP2A6*4、CYP2A6*5、CYP2A6*7、 CYP2A6*9和CYP2A6*10五個(gè)CYP2A6多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)。3.基因分型與數(shù)據(jù)分析利用iMLDR技術(shù)在中國(guó)南方肺癌患者和健康對(duì)照者中進(jìn)行nAChR基因多態(tài)性分型：同時(shí)采用多重LONG-PCR電泳與SNaPshot相結(jié)合的方法對(duì)CYP2A6進(jìn)行基因多態(tài)性檢測(cè)并整理檢測(cè)結(jié)果,利用SPSS13.0軟件進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析。探討各個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性分布與肺癌患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系,驗(yàn)證中國(guó)南方男性肺癌易感SNP位點(diǎn)。4.對(duì)各位點(diǎn)多態(tài)性與肺癌患者的吸煙狀態(tài)、病理類(lèi)型、解剖位置等相關(guān)性進(jìn)行分析；探討基因型分布與吸煙行為在肺癌中的交互作用。5.探討nAChR基因多態(tài)性之間、nAChR與CYP2A6基因多態(tài)性之間對(duì)肺癌發(fā)生存在的交互作用。結(jié)果：第一部分nAChR和CYP2A6基因多態(tài)性與肺癌發(fā)生的關(guān)系本研究選取了尼古丁乙酰膽堿受體基因的5個(gè)SNPs位點(diǎn),在204例南方男性肺癌患者和821例健康對(duì)照人群中進(jìn)行了基因分型和統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示,除rs11072768外,其它4個(gè)位點(diǎn)的基因分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡(P0.05),病例對(duì)照分析發(fā)現(xiàn)1個(gè)與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn),即位于CHRNB2基因上的rs2072660位點(diǎn),與C/C基因型相比,C/T基因型攜帶者的肺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)升高,OR值(95%CI)為1.708(1.169-2.496),P=0.006。本研究對(duì)204例南方男性肺癌患者和821例健康對(duì)照人群中的CYP2A6代謝分型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示,與正常代謝組相比,中間代謝組、慢代謝組肺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)降低,OR值(95%CI)分別為0.142(0.041-0.485),P0.001、0.561(0.316-0.996),P0.048。低代謝組肺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)升高,OR值(95%CI)為2.334(1.552-3.581),P0.001。本研究分析結(jié)果顯示對(duì)肺癌組各基因多態(tài)性與患者的病理類(lèi)型無(wú)關(guān)；但就解剖位置而言,CHRNB2 rs2072659的G/G基因型可增加發(fā)生非周?chē)头伟┑娘L(fēng)險(xiǎn),OR值(95% CI)為8.360(1.153-60.623), CYP2A6低代謝型發(fā)生周?chē)头伟┑娘L(fēng)險(xiǎn)降低,OR值(95% CI)為0.453(0.223-0.921)。第二部分nAChR和CYP2A6基因多態(tài)性及基因型-基因型間的交互作用對(duì)吸煙行為的影響本研究分析結(jié)果顯示CHRNB2rs2072660 C/T基因型較C/C基因型相比,發(fā)生吸煙的風(fēng)險(xiǎn)降低(OR=0.710,95%CI=0.530-0.953);另外相對(duì)于CYP2A6正常代謝型而言,中間代謝(OR=5.809,95%CI=0.2611-12.924)、慢代謝型(OR=1.713,95%CI=1.107-2.649)者吸煙的風(fēng)險(xiǎn)增加,而低代謝型(OR=0.466,95%CI=0.338-0.643)者發(fā)生吸煙的風(fēng)險(xiǎn)降低。同時(shí),進(jìn)一步交互作用分析結(jié)果顯示CHRNA3rs6495308C/T基因型并CYP2A6代謝分型為低代謝者對(duì)吸煙行為的發(fā)生存在正交互作用(OR=2.000,95%CI:1.021-3.919),表明兩者同時(shí)存在的個(gè)體吸煙行為風(fēng)險(xiǎn)增加。其余基因型之間對(duì)吸煙行為不存在交互作用。第三部分吸煙、nAChR、CYP2A6基因多態(tài)性三者間對(duì)肺癌發(fā)生的交互作用本研究對(duì)nAChR基因多態(tài)性之間對(duì)肺癌的交互作用、nAChR與CYP2A6基因多態(tài)性之間對(duì)肺癌的交互作用、吸煙與nAChR基因多態(tài)性之間對(duì)肺癌的交互作用、吸煙與CYP2A6基因多態(tài)性之間對(duì)肺癌的交互作用進(jìn)行了分析。多因素logistic回歸分析結(jié)果表明：在控制年齡、職業(yè)、文化程度、吸煙和婚姻狀況等混雜因素之后,CHRNA3rs6495308C/T基因型并CHRNB2rs2072659G/C基因型者、CHRNA3rs6495308C/T基因型并CHRNA4rs3787140C/T基因型者CHRNA3rs6495308C/T基因型并CHRNB2rs2072660C/T基因型者對(duì)肺癌的發(fā)生均存在負(fù)交互作用,OR值分別為0.378 (95%CI:0.170～0.841)、0.268 (95%CI: 0.107～0.670)、0.277 (95%CI:0.124～0.620)。在控制年齡、職業(yè)、文化程度和婚姻狀況等混雜因素之后,CYP2A6代謝分型為低代謝并每天吸煙0-15支者(OR=13.194,95%CI:2.394～72.716)、CYP2A6代謝分型為低代謝并每天吸煙15支者(OR=4.348,95%CI:1.672～11.308)對(duì)肺癌的發(fā)生存在正交互作用。其余不存在交互作用。結(jié)論：1. 本研究結(jié)果顯示位于CHRNB2基因rs2072660位點(diǎn)與中國(guó)南方男性肺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān),其中rs2072660位點(diǎn)C/T基因型可能增加個(gè)體肺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)；CHRNB2 rs2072659的G/G型可增高發(fā)生非周?chē)头伟┑娘L(fēng)險(xiǎn),CYP2A61氏代謝型發(fā)生周?chē)头伟┑娘L(fēng)險(xiǎn)降低；CHRNB2rs2072660 C/T基因型發(fā)生吸煙的風(fēng)險(xiǎn)降低,CYP2A6中間代謝、慢代謝型者吸煙的風(fēng)險(xiǎn)增加,而低代謝型者發(fā)生吸煙的風(fēng)險(xiǎn)降低。2. 交互作用分析結(jié)果顯示,CHRNA3rs6495308 C/T基因型并CYP2A6低代謝型者對(duì)吸煙行為的發(fā)生存在正交互作用；CHRNB2 rs2072660基因多態(tài)性與CHRNA3 rs6495308基因多態(tài)性對(duì)肺癌存在負(fù)交互作用,CHRNA3rs6495308基因多態(tài)性與CHRNB2 rs2072659基因多態(tài)性對(duì)肺癌存在負(fù)交互作用,CHRNA3 rs6495308基因多態(tài)性與CHRNA4 rs3787140基因多態(tài)性對(duì)肺癌負(fù)交互作用,CYP2A6基因多態(tài)性與吸煙行為對(duì)肺癌存在正交互作用。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類(lèi)】：R734.2
【部分圖文】：

ＡＢＩＳＮＰｋｘＴＭ?Ａｓｓａｙ?等。??本研究中對(duì)于ｎＡＣｈＲ基因多態(tài)性的檢測(cè)采用的方法是ｉＭＬＤＲ技術(shù)，該技??術(shù)的原理為（圖３）；首先對(duì)于突變所在區(qū)段先采用多重ＰＣＲ反應(yīng)在一個(gè)體系??中獲得擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)外切核酸酶及郵堿酶（ＥｘｏＩ／ＳＡＰ）純化后用于后續(xù)??１５??

Ｆｉｇ．３?Ｔｈｅ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?出ｅ?ｉＭＬＤ民化ｃｈｎｏｌｏｇｙ??對(duì)于ＣＹＰ２Ａ６基因多態(tài)性的檢測(cè)我們采用多重ＬＯＮＧ－ＰＣ民電泳與??ＳＮａＰｓｈｏｔ相結(jié)合的方法。ＳＮａＰｓｈｏｔ技術(shù)原理（見(jiàn)圖４）是首先使用引物擴(kuò)增目??標(biāo)ＳＮＰｓ所在片段，在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入核酸外切酶Ｉ?（Ｅｘｏ?Ｉ）和堿性磯酸酶??（Ｓｈｒｉｍｐ?Ａｌｋａｌｉｎｅ?Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，?ＳＡＰ）消化掉反應(yīng)體系中的引物序列和剩余的??腳ＴＰｓ；然后，Ｗ純化后的擴(kuò)増產(chǎn)物為模板，使用測(cè)序酶、四種炎光標(biāo)記ｄｄＮＴＰ??和５＇－端緊靠ＳＮＰ位點(diǎn)的延伸引物進(jìn)行ＰＣＲ反應(yīng)，引物延伸一個(gè)堿基即終止，??經(jīng)ＡＢＩ測(cè)序儀檢測(cè)后，按照峰的移動(dòng)位置確定該延伸產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的ＳＮＰ位點(diǎn)，根??據(jù)峰的顏色可得知慘入的堿基種類(lèi)，從而確定該樣本的基因型。其優(yōu)點(diǎn)在于：??１．分型準(zhǔn)確；２．通量高：也稱(chēng)小測(cè)序；３．檢測(cè)速度快；４．不受ＳＮＰ位點(diǎn)多態(tài)性特??性限制；５．不受樣本個(gè)數(shù)限制。??１７??

圖５?ＳＮａＰｓｈｏｔ毛細(xì)管電泳峰形圖??Ｆｉｇ．５?Ｔｈｅ?ｃａｐｉｌｌａｒｙ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｐｅａｋ?ｇｒａｐｈ?ｏｆ?ＳＮａＰｓｈｏｔ??ｆ．統(tǒng)計(jì)分析??

本文編號(hào)：2858712