課題組前期研究證實(shí):腫瘤細(xì)胞釋放自噬小體(TRAP)通過(guò)TLR2-MyD88-NF-κB信號(hào)途徑誘導(dǎo)B細(xì)胞成為分泌高水平IL-10的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(IL-10~+Breg細(xì)胞),并依賴IL-10抑制T細(xì)胞的活化及其抗腫瘤作用;同時(shí)發(fā)現(xiàn):TRAP能通過(guò)TLR4-MyD88-p38信號(hào)通路誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞成為高表達(dá)PD-L1和IL-10的M2樣巨噬細(xì)胞,并通過(guò)PD-L1/PD-1和IL-10抑制T細(xì)胞的活化及其抗腫瘤作用。但是,TRAP是否能夠調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞功能并在腫瘤免疫中發(fā)揮相應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)作用,有待進(jìn)一步研究。目的:探討腫瘤細(xì)胞釋放自噬小體(TRAP)是否調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)行為,研究TRAP誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,初步探討吞噬TRAP的中性粒細(xì)胞是否對(duì)T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞具有調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。方法:1.腫瘤細(xì)胞釋放自噬小體(TRAP)調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)行為的研究人外周血中性粒細(xì)胞,與不同濃度CFSE標(biāo)記的TRAP共孵育3 h;或與3μg/mL CFSE標(biāo)記的TRAP共孵育不同時(shí)間;或與3μg/mL CFSE標(biāo)記的TRAP在4℃和37℃孵育3 h,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中性粒細(xì)胞吞噬CFSE標(biāo)記TRAP的比例。人外周血中性粒細(xì)胞,與不同濃度TRAP共孵育6 h;或與3μg/mL TRAP共孵育不同時(shí)間;或與3μg/mL的肺癌、卵巢癌和乳腺癌病人瘤性胸/腹水TRAP共孵育6 h,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中性粒細(xì)胞凋亡比例。2.中性粒細(xì)胞攝取TRAP及其誘發(fā)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究人外周血中性粒細(xì)胞,分別與CD(10μg/mL)、CPZ(4μg/mL)、Filipin III(12μg/mL)和EIPA(20μM)預(yù)處理30 min,再與3μg/mL CFSE標(biāo)記的TRAP共孵育3 h,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中性粒細(xì)胞吞噬CFSE標(biāo)記TRAP的比例;或分別與CD(10μg/mL)、CPZ(4μg/mL)、Filipin III(12μg/mL)和EIPA(20μM)預(yù)處理30 min,再與10μg/mL的TRAP共孵育6 h,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中性粒細(xì)胞凋亡比例。人外周血中性粒細(xì)胞,與不同濃度TRAP共孵育30 min;或分別與DPI(20μM)和NAC(7.5 mM)預(yù)處理30 min,再與10μg/mL的TRAP共孵育30 min,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中性粒細(xì)胞內(nèi)ROS含量;或分別與DPI(20μM)和NAC(7.5 mM)預(yù)處理30 min,再與10μg/mL的TRAP共孵育6 h,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中性粒細(xì)胞凋亡比例。人外周血中性粒細(xì)胞,分別與CD(10μg/mL),EIPA(20μM)和DPI(20μM)預(yù)處理30min,再與10μg/mL的TRAP共孵育24 h,檢測(cè)中性粒細(xì)胞caspase-3活性;或與zVAD-fmk(50μM)預(yù)處理30 min,再與10μg/mL的TRAP共孵育6 h,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中性粒細(xì)胞凋亡比例。3.吞噬TRAP的中性粒細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制的初步探討3.1吞噬TRAP的中性粒細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制人外周血中性粒細(xì)胞,與不同濃度TRAP共孵育30 min,收獲細(xì)胞,再與CFSE標(biāo)記的PBMC共培養(yǎng)6天,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4~+和CD8~+T細(xì)胞增殖情況。或與30μg/mL的TRAP在37℃共孵育30 min,收獲細(xì)胞,再與PBMC共培養(yǎng)3天,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IFN-γ~+T細(xì)胞比例,ELISA檢測(cè)共培養(yǎng)上清中IFN-γ含量;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4~+和CD8~+T細(xì)胞表面CD69和CD137以及PD1和CTLA4表達(dá)情況。分離人外周血中性粒細(xì)胞,與NAC(7.5 mM)預(yù)處理30 min,再與30μg/mL的TRAP共孵育30 min,收獲細(xì)胞,并與CFSE標(biāo)記的PBMC共培養(yǎng)6天;或與CFSE標(biāo)記的PBMC用Transwell小室分開共培養(yǎng)6天,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4~+和CD8~+T細(xì)胞增殖情況。3.2吞噬TRAP的中性粒細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制3.2.1吞噬TRAP的人中性粒細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制人外周血中性粒細(xì)胞,與10μg/mL TRAP共孵育12 h,收獲中性粒細(xì)胞培養(yǎng)上清,用所獲上清培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞,觀察MDA-MB-231細(xì)胞遷移、劃痕愈合與侵襲情況�；蚺c3μg/mL TRAP共孵育6 h,qRT-PCR檢測(cè)TRAP誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞后CCL2和MMP9等分子的變化�；蚺c10μg/mL TRAP共孵育12 h,明膠酶譜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRAP誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞上清中MMP9酶活性�；蛟谒@上清中分別加入MMP9封閉抗體及同型對(duì)照抗體,再培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞,觀察MDA-MB-231細(xì)胞遷移與侵襲情況。3.2.2吞噬TRAP的小鼠中性粒細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的調(diào)節(jié)作用小鼠中性粒細(xì)胞,與3μg/mL CFSE標(biāo)記的TRAP共孵育3 h,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠中性粒細(xì)胞吞噬CFSE標(biāo)記TRAP的比例�；蚺c3μg/mL的TRAP共孵育6 h,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠中性粒細(xì)胞凋亡比例�；蚺c10μg/mL TRAP共孵育12 h,收獲小鼠中性粒細(xì)胞培養(yǎng)上清,用所獲上清培養(yǎng)Hepa1-6細(xì)胞,觀察Hepa1-6細(xì)胞遷移與侵襲情況。采用B16F10細(xì)胞尾靜脈輸注小鼠,構(gòu)建肺轉(zhuǎn)移腫瘤模型,同時(shí)分別尾靜脈輸注PBS,Neutrophil(培養(yǎng)基對(duì)照)和Neutrophil(TRAP處理),兩天后再次尾靜脈輸注PBS,Neutrophil(培養(yǎng)基對(duì)照)和Neutrophil(TRAP處理),接種第21天收獲各組小鼠的肺臟,觀察腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量及大小。結(jié)果:1.腫瘤細(xì)胞釋放自噬小體(TRAP)調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)行為的研究中性粒細(xì)胞能夠快速大量地吞噬TRAP,TRAP可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡。與DNase I和RNase A處理的TRAP相比,Proteinase K處理的TRAP誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡的比例明顯減少。與膜結(jié)構(gòu)完整的TRAP相比,膜破碎的TRAP不能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡。2.中性粒細(xì)胞攝取TRAP及其誘發(fā)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究與CPZ和Filipin III預(yù)處理組相比,CD預(yù)處理組中性粒細(xì)胞吞噬TRAP的比例明顯減少,同時(shí)中性粒細(xì)胞凋亡的比例也明顯減少。與未處理組相比,EIPA預(yù)處理組中性粒細(xì)胞吞噬TRAP的比例明顯減少,同時(shí)中性粒細(xì)胞凋亡的比例也明顯減少。不同濃度的TRAP處理中性粒細(xì)胞后,ROS表達(dá)增加;用DPI或還原劑NAC預(yù)處理中性粒細(xì)胞后,TRAP誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的ROS含量明顯減少,同時(shí)TRAP誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡的比例也明顯減少。與未處理組相比,CD、EIPA或DPI預(yù)處理中性粒細(xì)胞組caspase-3活性明顯減弱;用caspase家族抑制劑zVAD-fmk預(yù)處理中性粒細(xì)胞后,TRAP誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡的比例明顯減少。3.吞噬TRAP的中性粒細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制的初步探討3.1吞噬TRAP的中性粒細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制抗人CD3抗體聯(lián)合抗人CD28抗體可以誘導(dǎo)CD4~+和CD8~+T細(xì)胞增殖,加入吞噬TRAP的中性粒細(xì)胞后CD4~+和CD8~+T細(xì)胞增殖比例減少,且隨著TRAP濃度增加,CD4~+和CD8~+T細(xì)胞增殖比例逐漸減少,而加入未處理的中性粒細(xì)胞未影響CD4~+和CD8~+T細(xì)胞的增殖。與未處理的中性粒細(xì)胞組相比,吞噬TRAP的中性粒細(xì)胞組IFN-γ~+T細(xì)胞的數(shù)量減少,同時(shí)共培養(yǎng)上清中IFN-γ含量也減少。與未處理的中性粒細(xì)胞相比,吞噬TRAP的中性粒細(xì)胞減少CD4~+和CD8~+T細(xì)胞表面CD69和CTLA4的表達(dá),對(duì)CD137和PD1的表達(dá)無(wú)影響。與吞噬TRAP的中性粒細(xì)胞組相比,NAC預(yù)處理的吞噬TRAP的中性粒細(xì)胞組CD4~+和CD8~+T細(xì)胞增殖比例有所增加。進(jìn)一步采用Transwell小室培養(yǎng)方法將吞噬TRAP的中性粒細(xì)胞和PBMC隔開,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與混合培養(yǎng)組相比,Transwell隔開培養(yǎng)組CD4~+和CD8~+T細(xì)胞增殖比例明顯增加。3.2吞噬TRAP的中性粒細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制3.2.1吞噬TRAP的人中性粒細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制與培養(yǎng)基對(duì)照組和未處理中性粒細(xì)胞上清組相比,吞噬TRAP的中性粒細(xì)胞上清組MDA-MB-231細(xì)胞遷移數(shù)量增加,劃痕愈合增快,侵襲數(shù)量增加。TRAP誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞后,中性粒細(xì)胞中CCL2、MMP9和TNF-α的mRNA表達(dá)明顯增加;明膠酶譜實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TRAP誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞上清中MMP9酶活性明顯增加。與加了同型對(duì)照抗體的上清組相比,加了MMP9封閉抗體的吞噬TRAP的中性粒細(xì)胞上清組MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量減少。3.2.2吞噬TRAP的小鼠中性粒細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的調(diào)節(jié)作用小鼠中性粒細(xì)胞能夠吞噬TRAP,TRAP可以誘導(dǎo)小鼠中性粒細(xì)胞凋亡。與培養(yǎng)基對(duì)照組和未處理小鼠中性粒細(xì)胞上清組相比,吞噬TRAP的小鼠中性粒細(xì)胞上清組Hepa1-6細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量增加。與PBS對(duì)照組和未處理小鼠中性粒細(xì)胞組相比,吞噬TRAP的小鼠中性粒細(xì)胞組肺臟中B16F10腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量增多,體積增大。結(jié)論:1.人中性粒細(xì)胞通過(guò)大胞飲方式,高效、快速吞噬TRAP,并定位于溶酶體;2.TRAP通過(guò)觸發(fā)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生ROS并誘導(dǎo)caspase-3活化,進(jìn)而在體內(nèi)、體外促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡;3.吞噬TRAP的中性粒細(xì)胞依賴ROS和細(xì)胞直接接觸方式抑制T細(xì)胞增殖和IFN-γ產(chǎn)生;4.吞噬TRAP的中性粒細(xì)胞通過(guò)MMP9促進(jìn)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移與侵襲;5.吞噬TRAP的小鼠中性粒細(xì)胞促進(jìn)肝癌Hepa1-6細(xì)胞遷移與侵襲,并促進(jìn)黑色素瘤B16F10細(xì)胞體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移及生長(zhǎng)。
【學(xué)位單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R730.3
【部分圖文】：

采用同樣的檢測(cè)手段，我們證實(shí)了腫瘤病人瘤性胸/腹水中含有 LC3 II 陽(yáng)性的自噬小體（圖 1-1 D-E）。圖1-1 MDA-MB-231細(xì)胞上清和瘤性胸/腹水中募集到的自噬小體鑒定（A）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) MDA-MB-231 細(xì)胞上清募集到的沉淀表面 LC3 的表達(dá)（；B）Western blot檢測(cè) MDA-MB-231 細(xì)胞募集到的沉淀以及細(xì)胞裂解液中 LC3 I 和 LC3 II 的表達(dá)；（C） 透射電子顯微鏡檢測(cè)募集到的沉淀的生物學(xué)形態(tài)；（D） 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤病人瘤性胸/腹水中募集到的沉淀表面 LC3 的表達(dá)；（E） Western blot 檢測(cè) MDA-MB-231 細(xì)胞裂解液和瘤性胸/腹水中募集到的沉淀中 LC3 I 和 LC3 II 的表達(dá)；（F） 透射電子顯微鏡檢測(cè)瘤性胸/腹水中募集到的沉淀的生物學(xué)形態(tài)。

第一章 腫瘤細(xì)胞釋放自噬小體（TRAP）調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)行為的研究2.獲取純化的人外周血中性粒細(xì)胞為了獲得實(shí)驗(yàn)所需的純化的人外周血中性粒細(xì)胞，我們采用Ficoll分離液Histopaque1.077 和 Histopaque 1.119 對(duì)人外周血進(jìn)行密度梯度離心，分別采用瑞氏染色法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)手段鑒定人外周血中性粒細(xì)胞純度。瑞氏染色法結(jié)果顯示，與分離前白細(xì)胞相比，分離后所獲細(xì)胞幾乎多為含桿狀核和分葉核的中性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞少見(jiàn)（圖 1-2 A）。流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)：98%的細(xì)胞表達(dá)中性粒細(xì)胞特異性表面標(biāo)志 CD66b（圖 1-2B）。提示：密度梯度離心法獲得的人外周血中性粒細(xì)胞純度好，可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需。

共孵育 30 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著 TRAP 濃度增加，中性粒細(xì)胞凋亡比例增加（圖 1-5）。提示：TRAP 在體內(nèi)也能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡。圖1-5 TRAP體內(nèi)誘導(dǎo)小鼠腹腔中性粒細(xì)胞凋亡檢測(cè)1 mL1%糖原/生理鹽水溶液腹腔誘導(dǎo) Balb/c 小鼠中性粒細(xì)胞，糖原刺激 4 h 后，腹腔再注入 2 mL含不同濃度 TRAP（0，10，30 和 100 μg/mL）的生理鹽水溶液，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) TRAP 誘導(dǎo)小鼠腹腔中性粒細(xì)胞凋亡比例。我們又收取臨床肺癌、卵巢癌和乳腺癌腫瘤病人的瘤性胸/腹水，提取臨床病人的自噬小體，再與中性粒細(xì)胞共孵育。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，吞噬臨床病人來(lái)源的 TRAP后
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