發(fā)布時(shí)間：2020-10-22 02:02

　　 研究目的:研究和探討巨噬細(xì)胞中的Nlrp3炎性小體通路介導(dǎo)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移進(jìn)程的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法:1.結(jié)直腸癌(CRC)細(xì)胞單獨(dú)作用于巨噬細(xì)胞的檢測(cè):采用transwell遷移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CRC細(xì)胞上清對(duì)巨噬細(xì)胞的趨化作用,CRC細(xì)胞上清孵育巨噬細(xì)胞48h后,用免疫熒光雙染檢測(cè)巨噬細(xì)胞是否有Nlrp3炎性小體的激活,并用QPCR方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞的Nlrp3和IL-1β表達(dá)量變化,采用ELISA方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞的IL-1β的釋放量的變化。2.巨噬細(xì)胞與CRC共孵育后的檢測(cè):采用transwell遷移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證巨噬細(xì)胞與CRC共孵育后對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞(SW480)是否具有進(jìn)一步的促遷移作用;并用QPCR方法檢測(cè)共孵育后結(jié)直腸癌細(xì)胞的上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標(biāo)志物和金屬蛋白酶(MMPs)的表達(dá)量變化。3.IL-1β作用于CRC的檢測(cè):用不同濃度的IL-1β刺激CRC,采用transwell遷移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證IL-1β是否能促進(jìn)CRC遷移,并用QPCR方法檢測(cè)CRC的EMT標(biāo)志物和MMPs的表達(dá)量變化。4.在共培養(yǎng)系統(tǒng)中加入Nlrp3、caspase-1抑制劑(或采用Nlrp3-/-、caspase-1-/-、鼠的骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞系統(tǒng)),采用transwell遷移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證抑制劑(或基因敲除)是否能夠抑制巨噬細(xì)胞的促遷移作用。5.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):在C57小鼠脾臟種植MC38細(xì)胞進(jìn)行肝轉(zhuǎn)移模型的建立;觀察Nlrp3-/-小鼠與WT小鼠肝轉(zhuǎn)移情況的差異;采用免疫組化方法檢測(cè)肝組織切片中的NLRP3蛋白的表達(dá)和分布情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CRC上清對(duì)巨噬細(xì)胞具有趨化作用;CRC上清孵育巨噬細(xì)胞48h后,免疫熒光雙染檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了巨噬細(xì)胞的Nlrp3炎性小體激活,且巨噬細(xì)胞的Nlrp3和IL-1β表達(dá)量上調(diào),及IL-1β的釋放量增加。2.遷移實(shí)驗(yàn)證明巨噬細(xì)胞與CRC共孵育后對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞(SW480)具有進(jìn)一步的促遷移作用。3.IL-1β能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移,并使結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT的變化和MMP3的表達(dá)量的上調(diào)。4.在共孵育系統(tǒng)中,Nlrp3炎性小體通路通過(guò)不同種方法阻斷或者封閉后,以上共孵育促遷移作用能被Nlrp3小體通路的抑制劑或基因敲除所削弱。5.在肝轉(zhuǎn)移模型中發(fā)現(xiàn)Nlrp3-/-小鼠的肝臟轉(zhuǎn)移灶要明顯少于WT小鼠,腫瘤轉(zhuǎn)移被抑制。結(jié)論:結(jié)直腸癌病人組織中發(fā)現(xiàn),與腫瘤鄰近的正常組織相比,腫瘤微環(huán)境中含更多的CD68+細(xì)胞且高表達(dá)Nlrp3蛋白。在體外實(shí)驗(yàn)中,腫瘤細(xì)胞能夠趨化巨噬細(xì)胞,并能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞Nlrp3炎性小體的激活,使巨噬細(xì)胞的IL-11β分泌增加,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移。巨噬細(xì)胞的這種促癌作用能被Nlrp3信號(hào)通路的抑制劑或基因敲除所抑制。在小鼠肝轉(zhuǎn)移模型中,Nlrp3-/-小鼠的肝臟腫瘤灶明顯少于WT小鼠,腫瘤轉(zhuǎn)移被抑制。以上結(jié)果表明,Nlrp3炎性小體在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移起著重要作用,腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞與CRC相互作用后可以通過(guò)激活Nlrp3炎性小體進(jìn)一步促進(jìn)CRC的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究可能為結(jié)直腸癌這一惡性疾病提供一種新的治療策略。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.34
【部分圖文】：

１９例結(jié)直腸癌病人的腫瘤組織切片取自南方醫(yī)科大學(xué)病理科，我們對(duì)其中６??例進(jìn)行了巨噬細(xì)胞標(biāo)志物…ＣＤ６８及ＮＬＲＰ３蛋白的免疫熒光雙染分析，結(jié)果如??圖１－２所示，發(fā)現(xiàn)與鄰近的正常組織相比，腫瘤微環(huán)境中含更多的ＣＤ６８＋細(xì)胞且??高表達(dá)ＮＬＲＰ３蛋白。提示腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞的ＮＬＲＰ３炎癥小體相關(guān)通路??可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。??ＣＤ６８?ＮＬＲＰ３?ＤＡＰＩ??■■■■?■??■■■圔??圖１－２．代表性病例腫瘤組織及其鄰近正常組織的免疫熒光染色結(jié)果。??Ｆｉｇ．?１－２?Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ?ＩＦ?ｉｍａｇｅｓ?ｏｆ?ＮＬＲＰ３?ａｎｄ?ＣＤ６８?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｉｎ?ｐａｉｒｅｄ?ｔｕｍｏｒ?ａｎｄ?ａｄｊａｃｅｎｔ??ｔｉｓｓｕｅｓ．??１．５?小結(jié)??與腫瘤鄰近的正常組織相比，結(jié)直腸癌的腫瘤微環(huán)境中含更多的ＣＤ６８＋細(xì)??胞且高表達(dá)Ｎｌｒｐ３蛋白。提示腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞的Ｎｌｒｐ３炎癥小體可能參與??了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，但其中的具體作用及分子機(jī)制需進(jìn)一步探討。??１０??

小鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)ＧＭ－ＣＳＦ誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞（ＢＭＤＭ），細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，并伸出??偽足。我們采用Ｃｏｍｉｎｇ公司的ｔｒａｎｓｗｅｌｌ板檢測(cè)結(jié)直腸癌上清對(duì)巨嗤細(xì)胞的趨化??作用，隨機(jī)選�。祩�(gè)視野（２０〇Ｘ），趨化情況及統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖２－１－２所示：圖Ａ??顯示，人源巨噬細(xì)胞（Ｍ？）在人源結(jié)直腸癌細(xì)胞（ＳＷ４８０）的趨化下，其迀移??能力明顯增強(qiáng)，其遷移能力增強(qiáng)３倍以上，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜０．００１）；圖??Ｂ顯示，鼠源巨噬細(xì)胞（ＢＭＤＭ）在鼠源結(jié)直腸癌細(xì)胞（ＭＣ３８）的趨化下，其??遷移能力同樣明顯增強(qiáng)，其遷移能力增強(qiáng)５倍以上，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義??（Ｐ＜０．００１）。同時(shí)，在ＣＴ２６細(xì)胞中同樣出現(xiàn)相似的結(jié)果。這說(shuō)明結(jié)直腸癌細(xì)??２５??

?ＢＭＤＭ＋ＭＣ３８?ＢＭＤＭ＋ＣＴ２６??圖２－Ｍ．巨噬細(xì)胞與結(jié)直腸癌細(xì)胞共孵育示意圖??Ｆｉｇ?２－１－１．?Ｔｈｅ?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?Ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ?ｂｅｔｗｅｅｎ?ｍａｏｃｒｏｐｈａｇｅｓ?ａｎｄ?ＣＲＣ．??（２）結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞的趨化作用??ＴＨＰ－１經(jīng)ＰＭＡ誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞（Ｍｅ），細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，成葡萄串樣。??小鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)ＧＭ－ＣＳＦ誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞（ＢＭＤＭ），細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，并伸出??偽足。我們采用Ｃｏｍｉｎｇ公司的ｔｒａｎｓｗｅｌｌ板檢測(cè)結(jié)直腸癌上清對(duì)巨嗤細(xì)胞的趨化??作用，隨機(jī)選�。祩�(gè)視野（２０〇Ｘ），趨化情況及統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖２－１－２所示：圖Ａ??顯示，人源巨噬細(xì)胞（Ｍ？）在人源結(jié)直腸癌細(xì)胞（ＳＷ４８０）的趨化下，其迀移??能力明顯增強(qiáng)，其遷移能力增強(qiáng)３倍以上，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜０．００１）；圖??Ｂ顯示，鼠源巨噬細(xì)胞（ＢＭＤＭ）在鼠源結(jié)直腸癌細(xì)胞（ＭＣ３８）的趨化下，其??遷移能力同樣明顯增強(qiáng)，其遷移能力增強(qiáng)５倍以上，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義??（Ｐ＜０．００１）。同時(shí)
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本文編號(hào)：2850934