FEN1是一種多功能、結(jié)構(gòu)特異性的核酸酶,它在維持基因組穩(wěn)定性上起著重要的作用。體內(nèi)FEN1的合理調(diào)控對(duì)維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)是至關(guān)重要的。我們通過尋找與FEN1相互作用的蛋白而進(jìn)一步深入探究FEN1未知的功能。我們嘗試串聯(lián)親和純化等方法獲得了與FEN1相互作用的蛋白混合物并通過質(zhì)譜進(jìn)行鑒定。我們發(fā)現(xiàn)HSP70與FEN1相互作用并促進(jìn)FEN1的活性和BER的效率。近來,我們?cè)谌祟惏┌Y樣本中發(fā)現(xiàn)了 FEN1的突變,這暗示著突變可能會(huì)影響基因組的不穩(wěn)定性并導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。然而,FEN1功能缺失和癌癥易感性之間的確切關(guān)系仍然不清楚。我們利用與結(jié)直腸癌相關(guān)的突變體,并分別從分子生化水平、細(xì)胞水平和動(dòng)物模型三個(gè)層面對(duì)癌癥發(fā)生的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了闡述。首先我們構(gòu)建FEN1點(diǎn)突變,并表達(dá)純化重組蛋白。我們?cè)隗w外分析了重組蛋白對(duì)DNA底物的酶切活性以及結(jié)合力,發(fā)現(xiàn)這一突變失去FEN1的FEN、EXO和GEN活性但仍然保留與DNA的結(jié)合親和力。接下來我們分析了 L209P突變與野生型FEN1共存對(duì)其酶活性的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該突變以一種dominant-negative的方式影響野生型FEN1的功能。最后我們?cè)隗w外比較了SW480細(xì)胞的BER修復(fù)能力并同時(shí)用重組蛋白進(jìn)行了 LP-BER的重建。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該突變影響體外以及細(xì)胞內(nèi)的BER效率。我們還研究了 L209P突變?cè)诩?xì)胞水平的變化。過表達(dá)L209P突變使得SW480細(xì)胞對(duì)5-FU和H202的敏感性更高并且其細(xì)胞凋亡比例增加。過表達(dá)L209P突變的SW480細(xì)胞的內(nèi)源性損傷增加,表現(xiàn)為DNA雙鏈斷裂增加。并且該突變導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)更多的染色體畸變,包括細(xì)胞內(nèi)異倍體和染色體斷裂的頻率增加。此外,我們發(fā)現(xiàn)含L209P突變的細(xì)胞具有更高的克隆形成能力,并且突變細(xì)胞在小鼠異源生長(zhǎng)模型上腫瘤形成能力更強(qiáng)。綜上所述,與癌癥相關(guān)的FEN1基因的變異會(huì)影響機(jī)體的BER修復(fù)效率,并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。對(duì)該突變體的研究揭示了癌癥發(fā)生的分子機(jī)制�；谝陨系难芯堪l(fā)現(xiàn),FEN1功能對(duì)于正常細(xì)胞來講是必要的,FEN1功能缺失將導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。然而,與此同時(shí),在己經(jīng)轉(zhuǎn)化成腫瘤的細(xì)胞中,其FEN1的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中FEN1是高表達(dá)的,并且FEN1對(duì)于快速生長(zhǎng)的癌細(xì)胞是必須的。我們發(fā)現(xiàn)改變FEN1在細(xì)胞中的表達(dá)水平會(huì)改變癌細(xì)胞對(duì)于化療藥物的反應(yīng)。并且,對(duì)臨床腫瘤樣本的分析發(fā)現(xiàn),腫瘤中FEN1表達(dá)水平越高,腫瘤惡性程度就越高,病人的預(yù)后就越差。在細(xì)胞中抑制FEN1活性會(huì)引起DNA復(fù)制停滯和未修復(fù)的DNA中間體的積累,進(jìn)而導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂和細(xì)胞凋亡。因此,我們認(rèn)為,抑制FEN1活性將會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)�；谶@一設(shè)想,我們提出了以FEN1為靶點(diǎn)的抗腫瘤的策略。我們?cè)O(shè)計(jì)了一種全新的FEN1抑制劑(SC13),它可以特定的抑制FEN1的活性,并且影響岡崎片段的成熟和LP-BER,影響體內(nèi)和體外的DNA復(fù)制和修復(fù)。SC13抑制癌細(xì)胞增殖,并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DSBs和染色體斷裂的產(chǎn)生,癌細(xì)胞中染色體的不穩(wěn)定性進(jìn)一步會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。SC13和化療藥物聯(lián)合使用會(huì)增加癌細(xì)胞中的DSBs的頻率。更為重要的是,在用于小鼠的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)中,SC13表現(xiàn)出良好的抗腫瘤效果。當(dāng)SC13與化療藥物聯(lián)合使用時(shí),腫瘤抑制效果是比較明顯的,表明SC13聯(lián)合使用會(huì)增加癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。這些發(fā)現(xiàn)可以為乳腺癌和其他癌癥的治療提供參考。
【學(xué)位單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R730
【部分圖文】：

１三種活性的底物模式圖。箭頭的大小和粗細(xì)程度代表不同活性強(qiáng)度。紅色ＥＮ活性，藍(lán)色箭頭代表ＥＸＯ活性，橙色代表ＧＥＮ活性。??ｈｒｅｅ?ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ?ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ?ｏｆ?ＦＥＮ１．?Ｔｈｅ?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｉｔｈ?ｖａｒｉｏｕｓ?ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ．?ＦＥＮ１?ｐｏｓｓｅｓｓｅｓ?ｔｈｒｅｅ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ，?ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ?ＦＥｃｔｉｖｉｔｙ．?Ｔｈｅ?ｓｉｚｅ?ａｎｄ?ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ?ｏｆ?ａｒｒｏｗｓ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ?ｔｈｅ?ｓｔｒｅｎｇｔｈ?ｏｆ?ｔｈｅ?ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．?Ｃｏｌｅｓｅｎｔｓ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．?Ｒｅｄ，?ｆｌａｐ?ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ?ａｃｔｉｖｉｔｙ；?ｂｌｕｅ，?ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ?ａｃｔｉｖｉｔｙｃｌｅａｓｅ?ａｃｔｉｖｉｔｙ．??Ｎ１與底物結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)??關(guān)于ＦＥＮ１結(jié)構(gòu)的描述出現(xiàn)在噬菌體同系物中，Ｔ５?５＃亥酸外切酶是帶蛋白質(zhì)，允許單鏈ＤＮＡ?（ｓｓＤＮＡ）通過ｐ３］。與生化數(shù)據(jù)一致的是，菌的晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)表明，ＦＥＮ１通過圍繞疏水楔而優(yōu)先結(jié)合懸置的ｌｎｔ大小的３＇－ｆｌａｐ和５＇－ｆｌａｐｐ４］。酶的這種構(gòu)結(jié)構(gòu)的底部，并引導(dǎo)它允許ＦＥＮ１精確地切割ｌｎｔ直至下游雙鏈區(qū)切口＿。??ｒａｉ等人［３１］對(duì)人源ＦＥＮ１做了進(jìn)一步的研究，確認(rèn)ＦＥＮ１主要識(shí)別３＇－，。近，Ｔｓｕ

?第１章緒論?；???雖然在ＨＤ患者中沒有發(fā)現(xiàn)功能缺陷的ＦＥＮ１突變體，然而其他證據(jù)表明，ＦＥＮ１??可以抑制重復(fù)序列的擴(kuò)增［９７］。將包含ＴＯＲ重復(fù)序列的片段結(jié)構(gòu)底物與ＤＮＡ?ｌｉｇａｓｅ?Ｉ??和ＦＥＮ１同時(shí)孵育，發(fā)現(xiàn)ＦＥＮ１濃度增加會(huì)抑制環(huán)狀和發(fā)夾結(jié)構(gòu)中間體的形成，這些??中間體可以形成ＴＮＲ擴(kuò)增，這樣ＦＥＮ１就間接的抑制了?ＴＮＲ的擴(kuò)增［９８］。在釀酒酵母??中，ＦＥＮ１的缺乏大大增加了?ＴＮＲ的擴(kuò)增，遺傳分析表明ＦＥＮ１的ＥＸＯ和ＧＥＮ活??性均會(huì)抑制ＴＮＲ的擴(kuò)增［９９］。Ｌｉｕ和Ｗｉｌｓｏｎ提出，重復(fù)擴(kuò)增機(jī)制之一是ＬＰ－ＢＥＲ過程??中單鏈中間體上發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成［１％。這些結(jié)構(gòu)可以發(fā)生滑移，同時(shí)片段結(jié)構(gòu)也跟著??滑動(dòng)，使得ＦＥＮ１在錯(cuò)誤的位置切割，剩余的ＴＮＲ序列由連接酶連接留在了?ＤＮＡ中??并導(dǎo)致了?ＴＮＲ的擴(kuò)增。類似的ＴＮＲ擴(kuò)增過程在岡崎片段中間體形成時(shí)也可能發(fā)生。??錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)中蛋白發(fā)生突變也可以抑制ＴＮＲ擴(kuò)增［１Ｑ１，Ｉ（）２］。最近的研宄表明，錯(cuò)配??修復(fù)復(fù)合體Ｍｓｈ２－Ｍｓｈ３可以穩(wěn)定泡狀結(jié)構(gòu)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致ＦＥＮ１在不適當(dāng)?shù)牡胤??進(jìn)行切割，這似乎也會(huì)導(dǎo)致ＴＮＲ重復(fù)擴(kuò)增１１（）３］。??〇??

ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，?ｂａｓｅｄ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｋｎｏｗｎ?ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ?ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ?ａｎｄ?ｐａｔｈｗａｙｓ?ｏｆ?ｔｈｅｓｅ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ．??１．３．２?ＦＥＮ１在細(xì)胞內(nèi)的區(qū)室化??細(xì)胞內(nèi)定位是ＦＥＮ１功能調(diào)節(jié)的主要方式之一（圖１．４）［１３５］。在真核細(xì)胞內(nèi)，ＦＥＮ１??合成之后必須移到核內(nèi)才能發(fā)揮功能［１３６］。最初的序列分析發(fā)現(xiàn)真核ＦＥＮ１的Ｃ末端??有一信號(hào)序列，推測(cè)為核定位信號(hào)（ｎｕｃｌｅａｒ?ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ?ｓｉｇｎａｌ，ＮＬＳ），引導(dǎo)蛋白從細(xì)??胞質(zhì)進(jìn)入核內(nèi)。通過點(diǎn)突變發(fā)現(xiàn)有兩組帶正電荷的殘基ＫＲＫ?（Ｌｙｓ－３５４、Ａｒｇ－３５５、??Ｌｙｓ－３５６）和?ＫＫＫ?（Ｌｙｓ－３６５、Ｌｙｓ－３６６、Ｌｙｓ－３６７）是?ＦＥＮ１?核定位信號(hào)的關(guān)鍵殘基［１７］。??同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞周期的Ｓ期和發(fā)生ＤＮＡ損傷時(shí)會(huì)誘導(dǎo)更多ＦＥＮ１進(jìn)入細(xì)胞核［１７］。??近來首次發(fā)現(xiàn)，ＦＥＮ１在核仁中聚集，在參與停滯的ＤＮＡ復(fù)制叉分解和維持核糖體??ＤＮＡ?（ｒＤＮＡ）的穩(wěn)定性中起著重要的作用［１１５］。紫外照射（ＵＶ處理）之后，ＦＥＮ１??發(fā)生磷酸化后從核仁移到核漿
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