背景:肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,在全球所有惡性腫瘤相關死因中高居第二位�；熓歉伟┓鞘中g治療最常用的方法,然而目前仍然沒有明確的證據(jù)表明任何一種化療方案優(yōu)于其他方案。由于腫瘤異質性的廣泛存在,臨床醫(yī)生在選用化療方案時往往僅憑個人經(jīng)驗,導致肝癌化療療效的不確定性,有關資料顯示肝癌經(jīng)驗性化療的有效率甚至不足30%。在“精準醫(yī)療”(precision medicine)模式的推動下,肝癌個體化治療越來越受到人們的重視。而一系列臨床研究也相繼證實了腫瘤藥敏試驗(chemosensitivity test,CST)對于肝癌個體化治療具有重要的指導意義。然而,由于缺乏高級別的臨床證據(jù),人們對腫瘤藥敏試驗應用于臨床實踐依舊持謹慎的態(tài)度。傳統(tǒng)的肝癌藥敏試驗大多采用二維培養(yǎng)法,不能很好地模擬腫瘤細胞在體內(nèi)的微環(huán)境,使得藥敏試驗結果無法真實反映肝癌患者對化療藥物的敏感性。另一方面,肝癌藥敏試驗缺乏統(tǒng)一的技術標準,各研究中心的藥敏結果評判標準各不相同,極大地限制了肝癌藥敏試驗的推廣。鑒于此,一種基于三維培養(yǎng)系統(tǒng)的、采用準確可靠的藥敏評判標準的藥敏試驗方法是肝癌個體化治療未來的一大研究方向。目的:發(fā)明一種成本較低、簡單易行、穩(wěn)定可靠的三維藥敏試驗方法,為肝癌個體化化療提供重要指導。方法:第一章三維培養(yǎng)系統(tǒng)的構建與評價以商品化的三維培養(yǎng)系統(tǒng)GravityPLUS和AggreWell為借鑒設計模具,并用SOLIDWORKS 2016軟件繪制倒模圖,通過應用3D打印技術和注塑法構建三維培養(yǎng)系統(tǒng)。然后用三維培養(yǎng)系統(tǒng)對C3A細胞進行聚球培養(yǎng),同時以二維培養(yǎng)組作為對照,動態(tài)觀察兩組細胞的形態(tài)學變化及檢測其白蛋白(ALB)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、乳酸脫氫酶(LDH)水平。第二章人原代肝癌細胞的三維藥敏試驗采用膠原酶消化法和Percoll密度梯度離心法分離和純化人原代肝癌細胞,并用臺盼藍拒染法和免疫熒光染色進行計數(shù)和鑒定。用第一章構建的三維培養(yǎng)系統(tǒng)對分離得到的人原代肝癌細胞進行聚球培養(yǎng),同時以二維培養(yǎng)組作為對照,動態(tài)觀察兩組細胞的形態(tài)學變化。最后分別用八種化療方案處理兩組細胞,并用CCK-8法檢測細胞活力,通過敏感度分級、敏感指數(shù)和聯(lián)合指數(shù)三個指標對藥敏結果進行綜合評價。結果:第一章三維培養(yǎng)系統(tǒng)的構建與評價制作的PDMS模具具有良好的均一性,微孔均呈球形,無明顯鋸齒化。C3A細胞在接種三天后即可聚集成球,細胞球直徑因接種密度而異,最終可占滿整個微孔達到400μm。對C3A細胞的功能動態(tài)檢測顯示三維培養(yǎng)組的ALB、BUN水平明顯高于二維培養(yǎng)組,反映三維培養(yǎng)組的合成功能和解毒功能優(yōu)于二維培養(yǎng)組;而作為肝功能損害敏感指標的ALT、AST和LDH水平三維培養(yǎng)組總體低于二維培養(yǎng)組。第二章人原代肝癌細胞的三維藥敏試驗成功分離的兩例人原代肝癌細胞活率和純度分別大于90%和85%。兩例人原代肝癌細胞在接種至三維培養(yǎng)系統(tǒng)三天后即可聚集成球,且絕大多數(shù)散在細胞均能遷移至微孔中,成球效果明顯優(yōu)于C3A細胞。藥敏結果顯示,對于第一例人原代肝癌細胞(ID:2652968),二維培養(yǎng)組對ADM+DDP的聯(lián)合方案最敏感,而三維培養(yǎng)組對八種方案均耐藥;對于第二例人原代肝癌細胞(ID:2685241),二維培養(yǎng)組對ADM+DDP的聯(lián)合方案最敏感,而三維培養(yǎng)組對GEM+OXA最敏感。結論:本課題通過應用3D打印技術和注塑法構建的三維培養(yǎng)系統(tǒng)優(yōu)于傳統(tǒng)二維培養(yǎng)系統(tǒng),尤其適合人原代肝癌細胞的聚球培養(yǎng)。結合CCK-8法和敏感度分級、敏感指數(shù)及聯(lián)合指數(shù)三個指標能夠很好地評價人原代肝癌細胞對不同藥物的敏感性。在我們的實驗中,人原代肝癌細胞二維及三維藥敏結果存在較大差異,三維培養(yǎng)組對同一化療方案的敏感性普遍低于二維培養(yǎng)組,與文獻報道相符。該肝癌三維藥敏試驗方法具有成本低廉、操作簡便、可重復利用、成球效果良好、適合高通量藥物篩選等優(yōu)點,提高了檢測的準確性和穩(wěn)定性,能夠更合理地指導臨床科學用藥,為肝癌個體化治療提供重要參考。
【學位單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R735.7
【部分圖文】：

圖１－２?維培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)孔剖面圖??Ｆｉｇ?１－２?Ｃｒｏｓｓ－ｓｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?３Ｄ?ｃｕｌｔｕｒｅ?ｓｙｓｔｅｍ?ｗｅｌｌ??

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將ＳＯＬＩＤＷＯＲＫＳ?２０１６軟件中的設計圖另存為．ｓｔｌ文件，導入Ｒｅｔｉｎａｃｒｅａｔｅ??軟件做進一步處理（如設置參數(shù)，生成支撐等），然后將生成的．ｆｓｌｊｏｂ２文件拷入??Ｕ盤（圖１－５）。調平Ｐｈｏｅｎｉｘ?Ｔｏｕｃｈ?Ｐｒｏ?ＵＶ－ＬＥＤ?３Ｄ打印機，取下樹脂槽，并倒??入光敏樹脂（光敏樹脂需充分搖勻，至少兩分鐘），注意倒入光敏樹脂不可超過??樹脂槽固定架上的刻度，否則光敏樹脂可能在３Ｄ打印機工作時溢出。將Ｕ盤插??入３Ｄ打印機的ＵＳＢ接口，點擊Ｕ盤綠色按鈕，進入Ｕ盤文件界面，選擇文件??及樹脂類型開始打�。▓D１－６）。由于倒模較大，打印過程中可以暫停以添加光??敏樹脂。打印完成以后（約需２７小時），小心將成型托盤取出，取出前使用一??張ｌ〇Ｃｍｘｌ５ｃｍ的紙擋住托盤下方以防光敏樹脂濺落到機器內(nèi)部損壞機器。用小??平鏟鏟下成型托盤底面的倒模，用９５％的醫(yī)用酒精沖洗和浸泡倒模。最后去除??支撐并打磨倒模（圖１－７）。??１６??
【參考文獻】

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本文編號：2847731