背景:肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,在全球所有惡性腫瘤相關(guān)死因中高居第二位。化療是肝癌非手術(shù)治療最常用的方法,然而目前仍然沒有明確的證據(jù)表明任何一種化療方案優(yōu)于其他方案。由于腫瘤異質(zhì)性的廣泛存在,臨床醫(yī)生在選用化療方案時往往僅憑個人經(jīng)驗,導(dǎo)致肝癌化療療效的不確定性,有關(guān)資料顯示肝癌經(jīng)驗性化療的有效率甚至不足30%。在“精準(zhǔn)醫(yī)療”(precision medicine)模式的推動下,肝癌個體化治療越來越受到人們的重視。而一系列臨床研究也相繼證實(shí)了腫瘤藥敏試驗(chemosensitivity test,CST)對于肝癌個體化治療具有重要的指導(dǎo)意義。然而,由于缺乏高級別的臨床證據(jù),人們對腫瘤藥敏試驗應(yīng)用于臨床實(shí)踐依舊持謹(jǐn)慎的態(tài)度。傳統(tǒng)的肝癌藥敏試驗大多采用二維培養(yǎng)法,不能很好地模擬腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的微環(huán)境,使得藥敏試驗結(jié)果無法真實(shí)反映肝癌患者對化療藥物的敏感性。另一方面,肝癌藥敏試驗缺乏統(tǒng)一的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn),各研究中心的藥敏結(jié)果評判標(biāo)準(zhǔn)各不相同,極大地限制了肝癌藥敏試驗的推廣。鑒于此,一種基于三維培養(yǎng)系統(tǒng)的、采用準(zhǔn)確可靠的藥敏評判標(biāo)準(zhǔn)的藥敏試驗方法是肝癌個體化治療未來的一大研究方向。目的:發(fā)明一種成本較低、簡單易行、穩(wěn)定可靠的三維藥敏試驗方法,為肝癌個體化化療提供重要指導(dǎo)。方法:第一章三維培養(yǎng)系統(tǒng)的構(gòu)建與評價以商品化的三維培養(yǎng)系統(tǒng)GravityPLUS和AggreWell為借鑒設(shè)計模具,并用SOLIDWORKS 2016軟件繪制倒模圖,通過應(yīng)用3D打印技術(shù)和注塑法構(gòu)建三維培養(yǎng)系統(tǒng)。然后用三維培養(yǎng)系統(tǒng)對C3A細(xì)胞進(jìn)行聚球培養(yǎng),同時以二維培養(yǎng)組作為對照,動態(tài)觀察兩組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化及檢測其白蛋白(ALB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、乳酸脫氫酶(LDH)水平。第二章人原代肝癌細(xì)胞的三維藥敏試驗采用膠原酶消化法和Percoll密度梯度離心法分離和純化人原代肝癌細(xì)胞,并用臺盼藍(lán)拒染法和免疫熒光染色進(jìn)行計數(shù)和鑒定。用第一章構(gòu)建的三維培養(yǎng)系統(tǒng)對分離得到的人原代肝癌細(xì)胞進(jìn)行聚球培養(yǎng),同時以二維培養(yǎng)組作為對照,動態(tài)觀察兩組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。最后分別用八種化療方案處理兩組細(xì)胞,并用CCK-8法檢測細(xì)胞活力,通過敏感度分級、敏感指數(shù)和聯(lián)合指數(shù)三個指標(biāo)對藥敏結(jié)果進(jìn)行綜合評價。結(jié)果:第一章三維培養(yǎng)系統(tǒng)的構(gòu)建與評價制作的PDMS模具具有良好的均一性,微孔均呈球形,無明顯鋸齒化。C3A細(xì)胞在接種三天后即可聚集成球,細(xì)胞球直徑因接種密度而異,最終可占滿整個微孔達(dá)到400μm。對C3A細(xì)胞的功能動態(tài)檢測顯示三維培養(yǎng)組的ALB、BUN水平明顯高于二維培養(yǎng)組,反映三維培養(yǎng)組的合成功能和解毒功能優(yōu)于二維培養(yǎng)組;而作為肝功能損害敏感指標(biāo)的ALT、AST和LDH水平三維培養(yǎng)組總體低于二維培養(yǎng)組。第二章人原代肝癌細(xì)胞的三維藥敏試驗成功分離的兩例人原代肝癌細(xì)胞活率和純度分別大于90%和85%。兩例人原代肝癌細(xì)胞在接種至三維培養(yǎng)系統(tǒng)三天后即可聚集成球,且絕大多數(shù)散在細(xì)胞均能遷移至微孔中,成球效果明顯優(yōu)于C3A細(xì)胞。藥敏結(jié)果顯示,對于第一例人原代肝癌細(xì)胞(ID:2652968),二維培養(yǎng)組對ADM+DDP的聯(lián)合方案最敏感,而三維培養(yǎng)組對八種方案均耐藥;對于第二例人原代肝癌細(xì)胞(ID:2685241),二維培養(yǎng)組對ADM+DDP的聯(lián)合方案最敏感,而三維培養(yǎng)組對GEM+OXA最敏感。結(jié)論:本課題通過應(yīng)用3D打印技術(shù)和注塑法構(gòu)建的三維培養(yǎng)系統(tǒng)優(yōu)于傳統(tǒng)二維培養(yǎng)系統(tǒng),尤其適合人原代肝癌細(xì)胞的聚球培養(yǎng)。結(jié)合CCK-8法和敏感度分級、敏感指數(shù)及聯(lián)合指數(shù)三個指標(biāo)能夠很好地評價人原代肝癌細(xì)胞對不同藥物的敏感性。在我們的實(shí)驗中,人原代肝癌細(xì)胞二維及三維藥敏結(jié)果存在較大差異,三維培養(yǎng)組對同一化療方案的敏感性普遍低于二維培養(yǎng)組,與文獻(xiàn)報道相符。該肝癌三維藥敏試驗方法具有成本低廉、操作簡便、可重復(fù)利用、成球效果良好、適合高通量藥物篩選等優(yōu)點(diǎn),提高了檢測的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性,能夠更合理地指導(dǎo)臨床科學(xué)用藥,為肝癌個體化治療提供重要參考。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.7
【部分圖文】：

圖１－２?維培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)孔剖面圖??Ｆｉｇ?１－２?Ｃｒｏｓｓ－ｓｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?３Ｄ?ｃｕｌｔｕｒｅ?ｓｙｓｔｅｍ?ｗｅｌｌ??

圖Ｍ商品化的三維培養(yǎng)系統(tǒng)??Ｆｉｇ?１－１?Ｔｗｏ?ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ?３Ｄ?ｃｕｌｔｕｒｅ?ｓｙｓｔｅｍｓ?（ＧｒａｖｉｔｙＰＬＵＳ?ａｎｄ?ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ）??ｙ??圖１－２?維培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)孔剖面圖??Ｆｉｇ?１－２?Ｃｒｏｓｓ－ｓｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?３Ｄ?ｃｕｌｔｕｒｅ?ｓｙｓｔｅｍ?ｗｅｌｌ

將ＳＯＬＩＤＷＯＲＫＳ?２０１６軟件中的設(shè)計圖另存為．ｓｔｌ文件，導(dǎo)入Ｒｅｔｉｎａｃｒｅａｔｅ??軟件做進(jìn)一步處理（如設(shè)置參數(shù)，生成支撐等），然后將生成的．ｆｓｌｊｏｂ２文件拷入??Ｕ盤（圖１－５）。調(diào)平Ｐｈｏｅｎｉｘ?Ｔｏｕｃｈ?Ｐｒｏ?ＵＶ－ＬＥＤ?３Ｄ打印機(jī)，取下樹脂槽，并倒??入光敏樹脂（光敏樹脂需充分搖勻，至少兩分鐘），注意倒入光敏樹脂不可超過??樹脂槽固定架上的刻度，否則光敏樹脂可能在３Ｄ打印機(jī)工作時溢出。將Ｕ盤插??入３Ｄ打印機(jī)的ＵＳＢ接口，點(diǎn)擊Ｕ盤綠色按鈕，進(jìn)入Ｕ盤文件界面，選擇文件??及樹脂類型開始打印（圖１－６）。由于倒模較大，打印過程中可以暫停以添加光??敏樹脂。打印完成以后（約需２７小時），小心將成型托盤取出，取出前使用一??張ｌ〇Ｃｍｘｌ５ｃｍ的紙擋住托盤下方以防光敏樹脂濺落到機(jī)器內(nèi)部損壞機(jī)器。用小??平鏟鏟下成型托盤底面的倒模，用９５％的醫(yī)用酒精沖洗和浸泡倒模。最后去除??支撐并打磨倒模（圖１－７）。??１６??
【參考文獻(xiàn)】

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1 成琳;黃文斌;趙有財;趙建華;王勁松;;Arg-1、HepPar-1、GPC3和AFP檢測在肝細(xì)胞癌診斷中的價值[J];診斷病理學(xué)雜志;2015年10期

2 吳孟超;湯釗猷;劉彤華;叢文銘;步宏;陳杰;董輝;朱玉瑤;馮龍海;陳駿;;原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南(2015年版)[J];臨床肝膽病雜志;2015年06期

3 劉小珍;鄭智國;凌志強(qiáng);;腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)與保存[J];中國腫瘤;2015年04期

4 羅南書;羅南英;;體外肝細(xì)胞培養(yǎng)及在藥物篩選中的應(yīng)用[J];中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報;2015年01期

5 林滿洲;胡敏;吳桂林;繆輝來;朱潤芝;黃海麗;李明意;;組織薄片法在人原代肝癌細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用[J];嶺南現(xiàn)代臨床外科;2014年03期

6 聶磊;吳東德;張峰;夏曉勤;;化療藥物敏感試驗在肝細(xì)胞癌患者化療中的應(yīng)用[J];臨床肝膽病雜志;2013年08期

7 王士群;朱宇珍;鄭學(xué)寶;;Chou-Talalay在抗腫瘤聯(lián)合用藥中的研究應(yīng)用概況[J];中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué);2013年04期

8 趙逸超;汪艷;盧海;簡國登;潘明新;高毅;;一種適合肝細(xì)胞生長的無血清培養(yǎng)基[J];中國組織工程研究;2012年11期

9 柏帥;劉衛(wèi);聶磊;張志國;魏強(qiáng);;消化道腫瘤細(xì)胞與外周血淋巴細(xì)胞體外藥敏試驗相關(guān)性的研究[J];中華腫瘤防治雜志;2011年19期

10 安軍;付維利;丁潔;;L-谷氨酰胺與肝臟大部分切除后的再生[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年31期

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1 黎江;肝癌干細(xì)胞新型培養(yǎng)體系的建立以及治療靶點(diǎn)篩選[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2012年

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1 李杰;Arginase-1、Glypican-3、Hepatocyte paraffin antigen 1及α-fetoprotein在肝臟腫瘤診斷與鑒別診斷中的意義[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2012年

2 王威;進(jìn)展期胃癌原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶及外周血淋巴細(xì)胞體外藥敏相關(guān)性研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2007年

3 樓朝陽;人肝癌細(xì)胞系FHCC-98的建立及其生物學(xué)特性研究與體外藥理實(shí)驗[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2004年

本文編號：2847731