第一部分沉默Matriptase對胰腺癌細(xì)胞株SW1990生長的影響目的:探討沉默Matriptase對胰腺癌株SW1990體外生長的影響,并探討其對胰腺癌細(xì)胞株SW1990可能的作用機(jī)制。方法:根據(jù)Genbank中Matriptase的編碼區(qū)基因序列NM_021978.3及相關(guān)參考文獻(xiàn),合成特異性針對Matriptase的si RNA及與Matriptase無關(guān)的陰性對照si RNA,瞬時轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞株SW1990;實(shí)驗分為4組:陰性對照組(A組)、12.5 n M(B組)、25 n M(C組)、50 n M Matriptase-si RNA組(D組);利用real time PCR技術(shù)測定轉(zhuǎn)染后24h各組細(xì)胞中Matriptase在m RNA水平上的相對表達(dá)量;Western blot技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后24 h各組細(xì)胞Matriptase在蛋白水平的相對表達(dá)量;明膠酶譜檢測各組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24 h后Matriptase酶活性及MMP-9表達(dá)量的變化,CCK-8檢測各組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞增殖能力的變化;劃痕實(shí)驗檢測各組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞遷移力的變化;Transwell侵襲實(shí)驗檢測各組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞侵襲力的變化。Western blot檢測各組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24 h后u PA/pro-u PA、HGF、AKT、p-AKT、E-cadherin表達(dá)量的變化。結(jié)果:(1)胰腺癌細(xì)胞株SW1990、As PC-1中都有Matriptase的高表達(dá),SW1990、As PC-1的蛋白表達(dá)量分別為(0.94±0.63)、(1.58±0.15);胰腺癌細(xì)胞株P(guān)a TU8988中無Matriptase的表達(dá)。(2)胰腺癌細(xì)胞株SW1990在轉(zhuǎn)染NC、12.5 n M、25 n M、50 n M Matriptase-si RNA 24 h后,各組Matriptase m RNA水平分別為1、0.44±0.05、0.28±0.04、0.25±0.07;但Matriptase蛋白表達(dá)水平分別是0.74±0.06、0.49±0.04、0.34±0.01、0.24±0.05。(3)Matriptase-si RNA轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖力的變化,各組的24 h的吸光度分別為0.62±0.01、0.62±0.03、0.37±0.05、0.33±0.05;48 h的吸光度分別為0.77±0.05、0.69±0.03、0.48±0.02、0.42±0.05(4)A組及C組劃痕間距分別為0.061±0.013、0.368±0.014,可見C組細(xì)胞的遷移距離明顯降低;而A組和C組穿膜細(xì)胞數(shù)分別是(416±1.3)與(109±2.8),可見轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞株SW1990 Matriptase-si RNA后細(xì)胞的侵襲力明顯降低。(5)Matriptase-si RNA轉(zhuǎn)染前后Matriptase蛋白酶活性及MMP-9的變化,A、B、C、D各處理組的Matriptase酶活性分別1.50±0.16、1.21±0.27、0.64±0.16、0.62±0.03;MMP-9的活性分別為0.93±0.26、0.48±0.36、0.35±0.11、0.35±0.12。其中C組與D組的Matriptase酶活性及MMP-9活性明顯降低(6)經(jīng)轉(zhuǎn)染處理后A、B、C、D組的u PA/pro-u PA的比值分別為3.52±0.04、1.11±0.11、0.15±0.06、0.12±0.08;p-AKT各組的蛋白表達(dá)量分別為0.91±0.16、0.37±0.20、0.27±0.17、0.09±0.06;AKT蛋白相對表達(dá)量分別為1.13±0.05、1.01±0.11、1.22±0.19、1.03±0.37;E-cadherin蛋白相對表達(dá)量分別為1.20±0.09、0.87±0.92、0.85±0.08、0.63±0.26;結(jié)果示轉(zhuǎn)染Matriptase-si RNA后u PA/pro-u PA比值降低,p-AKT表達(dá)量減少,AKT及E-cadherin表達(dá)量無明顯變化。結(jié)論:沉默Matriptase使細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力明顯下降。其機(jī)制可能是抑制了Matriptase酶活性,導(dǎo)致pro-u PA的活化降低,進(jìn)而導(dǎo)致MMP-9的活化、AKT的磷酸化減弱,最后細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲下降。第二部分沉默Matriptase對胰腺癌細(xì)胞株SW1990移植瘤生長的影響目的:探討沉默Matriptase對胰腺癌株移植瘤體內(nèi)生長的影響,并探討其在體內(nèi)對胰腺癌細(xì)胞株移植瘤可能的作用機(jī)制。方法:(1)利用磷酸鈣沉淀法制備慢病毒,并轉(zhuǎn)導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞株SW1990用于干擾Matriptase的表達(dá),利用倒置熒光顯微鏡及流式細(xì)胞分析儀檢測轉(zhuǎn)染效果,流式細(xì)胞分選儀進(jìn)行細(xì)胞分選,收集穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株;Western blot技術(shù)檢測干擾效果。(2)建立胰腺癌皮下移植瘤模型:將4周的BALB/c雌性裸鼠分為兩組,分別為空載體組(sh NC組)、轉(zhuǎn)染組(sh MT1),并監(jiān)測小鼠的體重、腫瘤大小,待腫瘤體積長至500 mm3后,動物成像儀拍照。頸椎脫臼法處死小鼠,皮下剝離腫瘤,去除包膜,記錄腫瘤的重量及體積。(3)將取下的腫瘤組織Western blot及免疫組化檢測各組腫瘤組中Matriptase、MMP-9、E-cadherin量的變化。結(jié)果:(1)sh NC組在第7、14、21、28、35天的腫瘤體積分別為(2.236±0.024)mm3、(52.60±0.082)mm3、(130.4±0.023)mm3、(308.1±0.283)mm3、(568.2±0.048)mm3,sh MT1組在第7、14、21、28、35天的腫瘤體積分別為(2.197±0.035)mm3、(21.46±0.022)mm3、(78.61±0.012)mm3、(102.7±0.120)mm3、(150.8±0.036)mm3;sh NC組的腫瘤重量為0.96±0.27,抑瘤率為(0.0±0.0)%;sh MT1組的腫瘤重量為0.43±0.13,抑瘤率為(55.2±2.7)%,可以發(fā)現(xiàn)sh MT1組腫瘤體積及重量都明顯降低。(2)sh NC組的Matriptase、MMP-9、E-cadherin的蛋白相對表達(dá)量分別為2.23±0.75、0.58±0.11、1.12±0.22;sh MT1組的Matriptase、MMP-9、E-cadherin的蛋白相對表達(dá)量分別為0.19±0.03、0.09±0.03、1.02±0.07,可發(fā)現(xiàn)sh MT1組中的MMP-9表達(dá)量明顯降低,而E-cadherin的表達(dá)無顯著差異。(3)sh NC組中Matriptase、MMP-9免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞指數(shù)分別為(85±6.78)%、(95±4.50)%;sh MT1組中Matriptase、MMP-9免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞指數(shù)分別為(15±2.45)%、(35±2.35)%,同樣發(fā)現(xiàn)sh MT1組移植瘤組織中MMP-9表達(dá)量明顯降低。而E-cadherin的表達(dá)在sh NC組及sh MT1組中無明顯差異。結(jié)論:沉默Matriptase在裸鼠胰腺癌移植瘤體內(nèi)可抑制腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移,其機(jī)制可能與MMP-9的下調(diào)有關(guān)。
【學(xué)位單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R735.9
【部分圖文】：

圖 1：Matriptase 的分子結(jié)構(gòu)示意圖究發(fā)現(xiàn) Matriptase 可以與肝細(xì)胞生長因子前體（pro-HGF）[7-9]、尿激-uPA）[10]、蛋白酶激活受體 2（PAR-2）[11]等底物結(jié)合，通過活化上述的蛋胞的生物學(xué)行為，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能，如維持上皮細(xì)胞的完整性、、促進(jìn)細(xì)胞的遷移與神經(jīng)細(xì)胞的分化，也可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移[12]等多研究發(fā)現(xiàn) Matriptase 與上皮來源的實(shí)體腫瘤密切相關(guān)。Matriptase 最胞中被發(fā)現(xiàn)，在前列腺[13]、結(jié)腸[14]、腎臟[15]、肝臟[16]、肺臟[17]和卵巢[瘤均能檢測到 Matriptase 的過表達(dá)，部分腫瘤中，Matriptase 高表達(dá)與級及臨床預(yù)后不良密切相關(guān)，如宮頸癌[19]、乳腺癌[20]等。已有研究者分析胰腺癌的組織標(biāo)本，發(fā)現(xiàn) Matriptase 在胰腺惡性組織中的表達(dá)明顯織，且在應(yīng)用 Matriptase 抑制劑后發(fā)現(xiàn) pro-uPA 酶原活化降低，并/cMet 的磷酸化并降低細(xì)胞的侵襲能力[21-22]。PA（urokinase-type plasminogen activator）是尿激酶型纖溶酶激活物的簡

圖 2：細(xì)胞侵襲實(shí)驗示意圖室準(zhǔn)備：提前一夜將 Matrigel 膠置于 4℃過夜溶解，將每個孔中，將 Matrigel 膠用無血清 DMEM 1:8 稀釋，每Matrigel 膠（注：不能有氣泡），37℃培養(yǎng)箱中干燥 30 min胞的準(zhǔn)備：將已經(jīng)轉(zhuǎn)染 NC-siRNA 和 Matriptase-siRNA0 用胰酶消化，1,000 rpm 離心 5 min，用無血清的 DME計數(shù)，按每小室 1×104個細(xì)胞加入上室中，每小室 20FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2晶紫染色并計數(shù)：取出小室，吸棄上室中的培養(yǎng)基，24 孔甲醇，小室置于其中固定 10 min，水洗三遍；結(jié)晶紫染再用棉簽將小室內(nèi)未穿過的基底膜的細(xì)胞擦拭掉，晾干個小室取 5 個視野，計數(shù)小室下層膜表面穿過膜的細(xì)胞

沉默 Matriptase 對胰腺癌細(xì)胞株 SW1990 及移植瘤生長的影響 第一部分AMatriptaseGADPHB C D圖 4：Western blot 檢測轉(zhuǎn)染 NC 及不同濃度 Matriptase-siRNA 后 Matriptase 表達(dá)水平，A:NC 組；B：12.5 nM；C：25 nM；D：50 nM表 5：各組處理組 Matriptase 蛋白與 GAPDH 灰度值比值（n=3， ±s）組別 Matriptase 蛋白/GAPDHA(對照組） 0.74±0.06B（12.5 nM） 0.49±0.04**C（25 nM） 0.34±0.10**
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 周國中,李兆申,鄒曉平;胰腺癌病因流行病學(xué)研究現(xiàn)狀[J];腫瘤防治雜志;2002年03期

本文編號：2845521