人體內(nèi)的所有器官都是由細(xì)胞組成,細(xì)胞的有序增長(zhǎng)和分化可以保持人的身體健康,但是細(xì)胞的異常分化會(huì)形成惡性腫瘤,即人們常說(shuō)的癌癥。惡性腫瘤長(zhǎng)得快、易轉(zhuǎn)移且難切除,對(duì)生命造成了嚴(yán)重的威脅。另外惡性腫瘤早期多無(wú)明顯癥狀,等患者出現(xiàn)癥狀時(shí),腫瘤已屬于晚期。因此,目前早期診斷及預(yù)防是治療惡性腫瘤最有效的手段。研究證明,細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的活性氧分子會(huì)引起氧化應(yīng)激,導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化和蛋白質(zhì)變性等,進(jìn)一步造成腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。另外,在惡性腫瘤的初期階段,某些蛋白質(zhì)會(huì)分泌異常。因此實(shí)現(xiàn)這些疾病標(biāo)志物(活性氧分子和蛋白質(zhì)等)的靈敏檢測(cè)對(duì)癌癥的診斷及治療評(píng)價(jià)等方面具有較大的實(shí)用價(jià)值。電致化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)是一門(mén)結(jié)合了電化學(xué)分析技術(shù)的高可控性和發(fā)光分析技術(shù)的高靈敏度的分析技術(shù)。ECL生物傳感器就是將ECL與生物傳感器相結(jié)合而發(fā)展起來(lái)的一類(lèi)生物傳感器,它不僅具有高可控性和高靈敏度,還具有優(yōu)異的特異性。這些優(yōu)點(diǎn)使得ECL生物傳感器能很好的應(yīng)用于生物分析檢測(cè)。在ECL機(jī)理研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)提高共反應(yīng)試劑的作用效率能提高發(fā)光體的ECL效率。另外在傳感器的構(gòu)建過(guò)程中,由于發(fā)光體的固載量直接決定了發(fā)光體的反應(yīng)數(shù)量,因此有效提高發(fā)光體的固載量能提高傳感器的發(fā)光強(qiáng)度。另外,提高目標(biāo)物的利用率也能增強(qiáng)ECL信號(hào)。鑒于此,為了進(jìn)一步提高ECL生物傳感器的靈敏度,本文主要利用納米材料及生物輔助放大策略來(lái)構(gòu)建一些快速且靈敏的ECL傳感器并進(jìn)行癌癥標(biāo)志物的檢測(cè)。主要內(nèi)容及結(jié)果如下:1.基于自增強(qiáng)型魯米諾衍生物及PdIr立方體模擬過(guò)氧化物酶的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的研究在眾多的信號(hào)放大策略中,同一分子內(nèi)同時(shí)含有發(fā)光基團(tuán)和共反應(yīng)基團(tuán)的自增強(qiáng)型ECL發(fā)光物質(zhì)能極大的提高發(fā)光物質(zhì)的發(fā)光效率,因?yàn)樵谕环肿觾?nèi)發(fā)光體與共反應(yīng)試劑之間的反應(yīng)距離較短因此能量損失也少。另外,由于自然過(guò)氧化物酶易失活且難分離,因此具有優(yōu)異穩(wěn)定性和模擬過(guò)氧化物酶性能的納米材料受到了廣泛關(guān)注。在本工作中,我們首先合成了具有高效過(guò)氧化物酶性質(zhì)的PdIr立方體,然后將L-半胱氨酸(L-Cys)和N-(4-氨基丁基)-N-乙基異魯米諾(ABEI)固定在PdIr立方體上合成了自增強(qiáng)型的ECL納米復(fù)合物(PdIr-L-Cys-ABEI)�；贚-Cys對(duì)ABEI的分子內(nèi)自增強(qiáng)及PdIr立方體對(duì)H_2O_2的有效催化信號(hào)放大策略,構(gòu)建了一個(gè)簡(jiǎn)單且靈敏度高的ECL免疫傳感器,并成功應(yīng)用于層粘連蛋白(LN)的測(cè)定。該方法為提高ABEI的發(fā)光效率及拓展其應(yīng)用提供了一種新的策略。2.以高效的新金屬有機(jī)骨架為信號(hào)探針構(gòu)建高靈敏電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器的研究在構(gòu)建ECL傳感器時(shí),提高發(fā)光效率最直接的方法是有效提高發(fā)光體的固載量,因?yàn)榘l(fā)光體的固載量直接決定了發(fā)光體的反應(yīng)數(shù)量。傳統(tǒng)的ABEI固載方法在一定程度上會(huì)限制ABEI的固載量,因此,在本研究中我們提出了一種有效固載大量ABEI的方法。我們用ABEI交聯(lián)的2-氨基對(duì)苯二甲酸作為有機(jī)橋連配體合成Fe-MIL-101(ABEI@Fe-MIL-101),這樣會(huì)使得大量ABEI固載在Fe-MIL-101的骨架上,因此所得的ABEI@Fe-MIL-101具有優(yōu)異的ECL性能。此外,為了避免使用共反應(yīng)試劑H_2O_2,為蛋白和細(xì)胞的檢測(cè)提供一個(gè)更安全的環(huán)境,我們通過(guò)控制電位使溶解氧轉(zhuǎn)化成超氧自由基(O_2˙ˉ)來(lái)進(jìn)一步增強(qiáng)ECL信號(hào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,所構(gòu)建的傳感器對(duì)MCF-7癌細(xì)胞上粘蛋白(MUC1)具有靈敏的檢測(cè),檢測(cè)限為12個(gè)細(xì)胞,表明該策略能為癌癥早期的生物標(biāo)志物診斷提供一個(gè)有效的方法。3.基于功能化三維多孔導(dǎo)電聚合物水凝膠構(gòu)建電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器的研究可靠且靈敏的原位檢測(cè)細(xì)胞釋放的小分子吸引了研究者們極大的興趣,因?yàn)檫@在病理生理學(xué)研究中具有重要的意義。在這個(gè)工作中,我們合成了發(fā)光物質(zhì)ABEI功能化的銀納米顆粒修飾的聚苯胺-植酸導(dǎo)電水凝膠(ABEI-Ag@PAni-PA)材料,并用其制備了一個(gè)ECL生物傳感器對(duì)細(xì)胞釋放的過(guò)氧化氫(H_2O_2)進(jìn)行了靈敏檢測(cè)。所制備的三維結(jié)構(gòu)的ABEI-Ag@PAni-PA既具有導(dǎo)電水凝膠優(yōu)異的導(dǎo)電性又具有納米催化劑優(yōu)異的催化性。另外,由于PAni水凝膠具有連續(xù)的三維骨架、多孔結(jié)構(gòu)和好的生物相容性,有利于ABEI-Ag的大量固載和細(xì)胞黏附。傳統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)H_2O_2的方法是將細(xì)胞置于溶液中,在該工作中我們將細(xì)胞黏附在ABEI-Ag@PAni-PA導(dǎo)電水凝膠上,與傳統(tǒng)的方法相比這為H_2O_2擴(kuò)散到反應(yīng)位點(diǎn)提供了短的擴(kuò)散距離,因此在藥物刺激下更能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)H_2O_2的靈敏檢測(cè)。結(jié)果表明,該ECL傳感器具有較好的生物相容性、較高的靈敏度且易制備,因此可以利用其去檢測(cè)細(xì)胞釋放的其他分子,有利于促進(jìn)病理生理學(xué)的研究。4.基于目標(biāo)物循環(huán)放大策略的電致化學(xué)發(fā)光信號(hào)轉(zhuǎn)換體系用于靈敏檢測(cè)Hg~(2+)和粘蛋白的研究在構(gòu)建傳感器時(shí),實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的循環(huán)利用是另一個(gè)提高傳感器信號(hào)的有效放大策略,,因?yàn)橥ㄟ^(guò)目標(biāo)物循環(huán)即使目標(biāo)物濃度很小傳感器也能檢測(cè)到一定的ECL信號(hào)。另外,有研究證明“on-off-on”信號(hào)轉(zhuǎn)換策略能提高傳感器的靈敏度,因?yàn)樗粌H能降低背景信號(hào),還能消除假陽(yáng)信號(hào)。在本工作中,我們首次發(fā)現(xiàn)汞離子(Hg~(2+))能有效猝滅ABEI的ECL信號(hào),且Hg~(2+)能通過(guò)T-Hg~(2+)-T作用很好的被固載。受此啟發(fā),我們構(gòu)建了一個(gè)基于Hg~(2+)引發(fā)的“on-off-on”型ECL適體傳感器用于超靈敏檢測(cè)Hg~(2+)和MUC1。為了進(jìn)一步提高適體傳感器的靈敏度,利用Exo I來(lái)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)MUC1的循環(huán)使用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本文提出的ECL適體傳感器能成功的應(yīng)用于較寬范圍內(nèi)Hg~(2+)和MUC1的靈敏檢測(cè)。5.基于蛋白-適體驅(qū)動(dòng)的三維DNA納米機(jī)器信號(hào)探針構(gòu)建電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器的研究在傳統(tǒng)檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法中,通常采用酶剪切或聚合將目標(biāo)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換成單鏈DNA來(lái)間接實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的循環(huán)使用,這使得實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)、花費(fèi)高且復(fù)雜。為了實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的直接循環(huán),在本論文中我們構(gòu)建了一個(gè)基于蛋白-適配體復(fù)合物驅(qū)動(dòng)的三維DNA納米機(jī)器信號(hào)探針的ECL生物傳感器并應(yīng)用于mucin1(MUC1)的靈敏檢測(cè)。在三維DNA納米機(jī)器信號(hào)探針的組裝過(guò)程中我們采用MUC1-適配體復(fù)合物作為催化發(fā)夾組裝的催化劑。這種方法不僅可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的直接循環(huán)使用,還可以實(shí)現(xiàn)發(fā)光物質(zhì)ABEI的有效固載。此外,我們用CoFe_2O_4磁性納米材料作為三維DNA納米機(jī)器信號(hào)探針的固載基質(zhì),不僅可以實(shí)現(xiàn)快速分離,還能催化共反應(yīng)試劑H_2O_2的分解產(chǎn)生羥基自由基(OH~·),實(shí)現(xiàn)ECL信號(hào)的放大。該研究方案結(jié)合了目標(biāo)物MUC1的循環(huán)和CoFe_2O_4的催化,實(shí)現(xiàn)了對(duì)MUC1的超靈敏檢測(cè)。因此,這種策略可以為臨床診斷(如微量蛋白檢測(cè))提供一種有效的,靈敏的檢測(cè)方法。
【學(xué)位單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R730.4;O657
【部分圖文】：

圖 1.1 魯米諾及其衍生物的分子結(jié)構(gòu)Fig. 1.1 The structure of luminuo and its derivatives魯米諾-H2O2的 ECL 反應(yīng)機(jī)理如圖 1.2 所示[4]。在堿性環(huán)境下，魯米諾先失一個(gè)質(zhì)子，再進(jìn)一步被電化學(xué)氧化形成偶氮化合物。同時(shí) H2O2分解產(chǎn)生超氧陰子 (HOO-) 或超氧自由基離子 (Oˉ˙)，他們與氧化生成的偶氮化合物產(chǎn)生激發(fā)態(tài)

圖 1.2 魯米諾-H2O2的 ECL 反應(yīng)機(jī)理[4] The ECL reaction mechanism of luminuo-H2O2system. Copyright 20-溶解 O2的 ECL 反應(yīng)機(jī)理如圖 1.3 所示[1]。魯米諾先被電物可以還原溶解 O2產(chǎn)生 O2ˉ˙，得到的 O2ˉ˙進(jìn)一步與魯米諾激發(fā)態(tài)的 2 價(jià)態(tài)的陰離子 3-氨基鄰苯二甲酸鹽，然后返回

圖 1.3 魯米諾-溶解 O2的 ECL 反應(yīng)機(jī)理[1].3 The ECL reaction mechanism of luminuo-O2system.
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本文編號(hào)：2837901