在全世界范圍內,惡性腫瘤是最重要的死亡原因。約40%的胃癌病例發(fā)生在中國。在我國,胃癌是常見癌癥第2位和惡性腫瘤死因第3位。胃癌具有惡性程度高,預后差等特點。盡管近年來胃癌的死亡率已有顯著的下降,但胃癌的五年生存率依舊很低。因此,早期診斷與早期治療是提高患者生存質量、降低死亡率的有效途徑。目前,胃癌的手術、化療、放療、靶向等常規(guī)治療的發(fā)展遇到了瓶頸。因此,為了更準確地進行診斷和預后評估,尋找新的、具有更高靈敏性和特異性的腫瘤標志物成為當前的關鍵問題。B細胞特異性莫洛尼小鼠白血病病毒結合位點-1(B-cell specific moloney leukemia virus insertion site 1,Bmi-1)是在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的第一個PcG基因家族成員。人類Bmi-1基因定位在10號染色體短臂(10p11.23),包括10個外顯子和9個內含子。該基因全長約3.4kb,編碼分子量為36.8 kDa的蛋白,由326個氨基酸組成。人類和小鼠Bmi-1基因編碼的產物氨基酸序列高度同源。Bmi-1蛋白的氨基端為RING指結構域,具有轉錄調節(jié)作用;中間為“螺旋 轉角 螺旋 轉角 螺旋 轉角基序”結構,為DNA結合結構域,與轉錄抑制有關;羧基端為PEST序列,與細胞內快速降解有關;氨基端高度保守的RING指結構,與其他RING指蛋白形成異源二聚體,再與其他成分相互結合,抑制其靶基因的轉錄。Bmi-1蛋白還包含2個核定位信號。Bmi-1在轉錄水平和轉錄后水平具有重要的調節(jié)作用。MicroRNA(miRNA)是由內源基因編碼的長度約22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子,參與轉錄后基因表達調控。人類約有1/3的基因受miRNA調控,每個miRNA可有多個靶基因,而一個靶基因也可受控于多個miRNA,這種復雜的調節(jié)網絡使miRNA和基因的關系緊密聯(lián)系在一起。MiRNA在調節(jié)基因功能方面發(fā)揮重要作用,如細胞增殖、凋亡、分化、代謝等,與腫瘤的形成亦有較大的關系。每個miRNA可有多個靶基因,而一個靶基因也可受控于多個miRNA,這種復雜的調節(jié)網絡使miRNA和基因的關系緊密聯(lián)系在一起。MiRNA在調節(jié)基因功能方面發(fā)揮重要作用,如細胞增殖、凋亡、分化、代謝等,與腫瘤的形成亦有較大的關系。許多miRNA被報道于腫瘤細胞系及臨床腫瘤組織樣本異常表達,部分miRNA參與腫瘤發(fā)生的抑制作用,另一部分可誘導或促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。此外,還有一部分miRNA起著致癌和抑癌的雙重作用。某些惡性腫瘤中,多種miRNA均可靶向作用調控Bmi-1 mRNA。如miR-15在卵巢癌中可直接下調Bmi-1的表達。Bmi-1作為一種癌基因或許能促進惡性腫瘤的發(fā)展。但Bmi-1在胃癌發(fā)生發(fā)展的具體作用尚不明確。胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多階段、多步驟、多因素參與的過程。本課題圍繞Bmi-1在胃癌中的表達、對胃癌細胞生物學行為的作用及其調控機制展開,首先針對Bmi-1在惡性腫瘤表達對患者預后的判斷價值開展薈萃分析,并在此基礎上開展以下實驗研究:(1)Bmi-1表達與胃癌患者臨床特征及預后的相關性;(2)胃癌中miR-15a的表達水平及與Bmi-1表達的相關性;(3)miR-15a調控Bmi-1對胃癌細胞生物學行為的作用機制。第一部分Bmi-1在惡性腫瘤的表達對患者預后判斷價值的薈萃分析目的:Bmi-1在多種惡性腫瘤中存在異常表達,并可作為患者的一項預后標志物。在此,我們進行了薈萃分析,以評估Bmi-1在惡性腫瘤的表達對患者預后的作用。方法:通過搜索Pubmed,Embase和Cochrane圖書館,這個三個數(shù)據庫中有關Bmi-1在腫瘤中表達與預后的臨床實驗(最后的搜索時間為2017年12月)。數(shù)據檢索和入選文獻質量評估由兩位作者各自獨立完成。Bmi-1陽性或高表達是根據文獻提供的臨界值定義。通過χ~2檢驗(評估P值)和計算I~2統(tǒng)計量,評估統(tǒng)計學異質性。結果:本研究共納入60篇文獻,61項研究。共納入來自十余個國家的8460例各種惡性腫瘤患者。研究質量的平均評分6.5分。亞組分析表明,Bmi-1高表達與各種腫瘤的不良預后顯著相關(HR=1.80,95%CI:1.55~2.09,P0.001)。在種族亞族分析中,Bmi-1高表達在中日韓患者中均是一項不良預后因素(HR=2.02,95%CI 1.74~2.35,P0.001);而與高加索人種(HR=1.15,95%CI 0.80~1.67,P=0.448)或其他國家患者(HR=1.51,95%CI 0.69~3.32,P=0.305)的OS無顯著相關性。Bmi-1高表達與多種腫瘤的總生存期(overall survival,OS)較短相關,包括胃癌(HR=1.57,95%CI 1.31~1.89,P0.001)、食管癌(HR=1.50,95%CI 1.07~2.08,P=0.019)、肺癌(HR=1.76,95%CI 1.29~2.41,P0.001)、宮頸癌(HR=2.81,95%CI 2.28~3.46,P0.001)、結直腸癌(HR=2.42,95%CI 1.83~3.21,P0.001)及其它腫瘤(HR=2.09,95%CI 1.49~2.92,P0.001)。而與頭頸部鱗癌(HR=1.45,95%CI 0.90~2.34,P=0.128)、乳腺癌(HR=1.02,95%CI 0.64~1.61,P=0.936)和肝癌(HR=1.64,95%CI 0.66~4.05,P=0.238)患者的OS無顯著相關性。在兩項乳腺癌研究中,Bmi-1高表達提示預后較好。入選文獻研究的異質性與出版時間(P=0.560)和腫瘤類型(P=0.334)無關,不存在顯著的發(fā)表偏倚。結論:Bmi-1高表達與胃癌、食管癌、肺癌、宮頸癌、結直腸癌等惡性腫瘤腫瘤的不良預后有關,而與頭頸部鱗癌、乳腺癌和肝癌患者的OS無顯著相關性�？傊�,Bmi-1對惡性腫瘤預后判斷的意義不一致,需通過較大樣本進一步分析。第二部分Bmi-1表達與胃癌患者臨床特征及預后的相關性目的:Bmi-1在多種惡性腫瘤中表達異常,并可作為一種腫瘤預后標志物。然而,Bmi-1對惡性腫瘤預后判斷的意義不一致,本研究擬通過352例胃癌及癌旁組織芯片進行驗證。方法:通過免疫組化方法在大樣本高密度腫瘤組織芯片中檢測Bmi-1在352名胃癌患者腫瘤組織及癌旁正常組織中的表達,結合TCGA數(shù)據庫的分析結果,應用多種統(tǒng)計學方法分析了Bmi-1表達情況與患者臨床病理特征及預后的相關性。結果:在352名胃癌患者的組織芯片中,Bmi-1蛋白存在于惡性腫瘤細胞的細胞核及細胞質中。Bmi-1在胃癌組織的表達水平顯著高于配對癌旁正常胃組織(P0.001)。TCGA數(shù)據庫資料統(tǒng)計結果提示胃癌組織中Bmi-1 mRNA的表達水平也顯著高于配對癌旁正常胃組織(P0.001)。Bmi-1表達水平與其它臨床病理特征均無顯著相關性(P0.05);Bmi-1高表達、腫瘤體積較大(≥5cm)、病理分級程度較高(Ⅲ~Ⅳ級)、腫瘤浸潤較深(較晚的T分期)、淋巴結轉移或轉移較多(70%或較晚的N分期)、遠處轉移(M1)、AJCC分期較晚均為胃癌患者的不良預后因素;Ⅰ~Ⅱ期胃癌患者的Bmi-1表達水平較Ⅲ~Ⅳ期患者顯著升高(P=0.021)。Ⅱ期胃癌患者的Bmi-1表達水平較III期患者顯著升高(P=0.035);Bmi-1蛋白高表達胃癌患者的中位生存期顯著長于Bmi-1低表達的患者(43.5月vs.24.5月,P0.05);淋巴結轉移患者中Bmi-1高表達患者的中位生存期顯著長于Bmi-1低表達患者(P=0.007)。結論:Bmi-1表達水平可作為胃癌一項獨立預后因素,胃癌組織中Bmi-1的高表達提示預后較好。第三部分胃癌組織中異常表達的miRNA與Bmi-1表達水平的相關性目的:鑒于第一部分與第二部分中Bmi-1表達對胃癌預后判斷價值的不一致,我們試圖尋找調控Bmi-1表達的上游miRNA,檢測候選miRNA和Bmi-1在胃癌組織中的表達,分析兩者的相關性。方法:通過初篩查找胃癌中可能表達異常的miRNA(包括miR-15a、miR-16和miR-200c)作為候選miRNA。獲取21塊胃癌組織及配對癌旁正常組織,應用實時PCR檢測了胃癌組織芯片中miR-15a的表達水平;應用熒光原位雜交技術檢測100例胃癌組織芯片中miR-15a的表達水平。通過免疫組化方法檢測了胃癌組織與組織芯片中Bmi-1蛋白表達水平。應用統(tǒng)計學方法分析其差異性,進而確定本研究的靶miRNA為miR-15a。通過原位雜交實驗和免疫組化方法檢測靶miRNA和Bmi-1在胃癌組織及配對癌旁正常組織中的表達,并分析兩者表達的相關性。結果:miR-15a在胃癌組織的表達較配對癌旁正常組織顯著降低(P=0.0239),而miR-16和miR-200c在胃癌組織和配對癌旁正常組織中的表達水平并無顯著差異;胃癌組織中miR-15a的高表達對應Bmi-1蛋白的低表達;胃癌組織芯片之中,Bmi-1表達水平和miR-15a表達水平均呈負相關(P=0.034,R2=0.22,r=-0.48)。結論:胃癌組織中,Bmi-1表達水平和miR-15a表達水平呈負相關。第四部分miR-15a調控Bmi-1對胃癌細胞增殖和侵襲的作用機制目的:探討miR-15a在胃癌細胞中對Bmi-1的調控機制,及Bmi-1對胃癌細胞生物學行為的作用。方法:選擇兩種胃癌細胞株,分別轉染入miR-15a;構建了Bmi-1 3'UTR載體,在胃癌細胞株中驗證Bmi-1是miR-15a的靶點。通過細胞增殖測定驗證外源性Bmi-1對胃癌細胞增殖的影響。通過transwell方法驗證外源性Bmi-1對胃癌細胞侵襲的影響。結果:1.胃癌細胞株中,證實miR-15a通過與Bmi-1 m RNA直接結合負性調控Bmi-1蛋白表達,Bmi-1是miR-15a的靶分子。胃癌細胞株AGS和SNU-5轉染miR-15a后增殖速率顯著下降(P0.001);2.外源性miR-15a可通過下調胃癌細胞株中Bmi-1蛋白表達從而降低胃癌細胞侵襲能力。結論:在胃癌中,Bmi-1是miR-15a的靶點,受其負性調控。Bmi-1促進胃癌細胞的增殖及侵襲能力,這種促進作用可能涉及多種機制。低表達Bmi-1的胃癌細胞增殖較慢,而高表達的細胞則增殖較快,從而對化療更敏感,化療療效更好。而化療療效好和預后較好相關。因此本課題中Bmi-1高表達患者生存時間較長的原因可能是因為這部分患者對化療更敏感。
【學位單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R735.2
【部分圖文】：

圖1.全球范圍內胃癌發(fā)病率和死亡率i-1 與腫瘤的關系 細胞特異性小鼠白血病病毒整合位點 1（B cell-specific Moloney murine ntegration site 1，Bmi-1），又稱Mel-18、Rae28、M33 及scmh1[3]。Bmi-1 在更新中起著重要的作用，在多種人類惡性腫瘤中均有表達[4-8]。近來有研 參與胃癌的發(fā)生，針對 Bmi-1 的基因治療可逆轉胃癌腫瘤細胞的耐藥[4,9].1 Bmi-1的結構和表達mi-1 是在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的第一個 PcG 基因家族成員。人類 Bmi-1 基因色體短臂（10p11.23），包括 10 個外顯子和 9 個內含子。該基因全長約子量為 36.8 kDa 的蛋白，由 326 個氨基酸組成。而小鼠 Bmi-1 基因產5 ~ 47kDa 的蛋白[4, 8]。人類和小鼠 Bmi-1 基因編碼的產物氨基酸序列高 蛋白與果蠅的兩個 RING 指蛋白 Ps（cposterior sex combs）和 Su（z）2（su

胃癌表達的臨床意義及調控機制研究 進一步評估。在種族亞族分析中，我們發(fā)現(xiàn) Bmi-1 高表達在中日韓患者良預后因素（HR = 2.02，95%CI 1.74 ~ 2.35，P < 0.001，見圖 3）；而與HR = 1.15，95%CI 0.80 ~ 1.67，P = 0.448，圖 4）或其他國家患者（HR 0.69 ~ 3.32，P = 0.305，圖 5）的 OS 無顯著相關性。

圖4. Bmi-1 高表達與高加索人種患者總生存期的關系圖5. Bmi-1 高表達與其它國家患者總生存期的關系了明確 Bmi-1 判斷預后適用的腫瘤類型，我們進行了腫瘤類型的亞組分一個研究評估 Bmi-1 對某種腫瘤的預后作用，這種腫瘤將被歸為“其他果表明，Bmi-1 高表達與多種腫瘤的 OS 較短相關，包括胃癌（HR = 1.57 1.89，P < 0.001）、食管癌（HR = 1.50，95%CI 1.07 ~ 2.08，P = 0.019） = 1.76，95%CI 1.29 ~ 2.41，P < 0.001）、宮頸癌（HR = 2.81，95%CI 2.28

【參考文獻】

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本文編號：2832612