研究背景和目的:乳腺癌是一種威脅性極強(qiáng)的惡性腫瘤,嚴(yán)重影響女性健康。對(duì)晚期的乳腺癌患者來(lái)說(shuō),轉(zhuǎn)移仍然是臨床上病人死亡的主要原因。蛋白激酶Cζ(Protein kinase Cζ,PKCζ)是非典型蛋白激酶C的異構(gòu)體,是癌癥中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。然而,PKCζ蛋白分子在調(diào)控腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子和細(xì)胞機(jī)制尚未完全了解。在這項(xiàng)研究中,我們結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)分析建立了PKCζ的相互作用蛋白質(zhì)(Protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò),進(jìn)一步了解PKCζ在乳腺癌中的生物學(xué)作用。研究方法:選取乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231,通過免疫共沉淀和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)的方法檢測(cè)PKCζ相互作用的蛋白質(zhì)。為了保證實(shí)驗(yàn)的可信性和重復(fù)性,我們?cè)O(shè)定了兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)和兩個(gè)技術(shù)重復(fù)。使用CRAPome數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選過濾,其目的是消除潛在的假陽(yáng)性結(jié)果。下一步將蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)合起來(lái)構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)。通過PANTHER和DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因本體論(Gene ontology,GO)分析和信號(hào)通路分析。接下來(lái),通過免疫共沉淀、免疫印跡和免疫熒光等方法,驗(yàn)證PKCζ和蛋白磷酸酶2催化亞基α(Protein phosphatase 2catalytic subunit alpha,PPP2CA)之間的相互作用。此外,在大規(guī)模臨床樣本數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行分析,通過TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和COSMIC數(shù)據(jù)庫(kù)分析PKCζ和PPP2CA表達(dá)量水平并進(jìn)行生存分析。結(jié)果:建立了以PKCζ為中心的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),其中包含178個(gè)相互作用蛋白和1225個(gè)相互作用關(guān)系。對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,結(jié)果表明所鑒定的蛋白質(zhì)與調(diào)節(jié)癌癥相關(guān)細(xì)胞過程的幾個(gè)關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)途徑顯著相關(guān)。結(jié)論:通過結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)分析,構(gòu)建了以PKCζ為中心的PPI網(wǎng)絡(luò),使我們對(duì)PKCζ在乳腺癌調(diào)節(jié)和細(xì)胞生物學(xué)方面的作用有了更全面的了解。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q811.4;R737.9
【部分圖文】：

網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：把數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和質(zhì)譜分析得到的 v2.8.3，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖；信號(hào)通路分析：將整理好的蛋白質(zhì)信息導(dǎo)入分析；系統(tǒng)生物學(xué)的方法對(duì)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò) 工具包（SBEToolbox）和 Cytoscape v2.8.3定度 k，聚類系數(shù)，小世界指數(shù)。發(fā)現(xiàn)，PKCζ 可以作為一種腫瘤標(biāo)志物[28]KCζ 在乳腺癌臨床樣本中的表達(dá)情況�；侔┎∪说� RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)：在乳腺高于正常組織（如圖 1）。

圖 2 PKCζ 生存分析GA 數(shù)據(jù)庫(kù)儲(chǔ)存的乳腺癌樣本信息中，PKCζ 高表達(dá)組的患者后更差；樣本量 n= 1445，effect size=0.6523，P=0.0011。好地了解 PKCζ 在腫瘤中扮演的角色，我們通過蛋白質(zhì)組學(xué)和結(jié)合的方法，建立了 PKCζ 相結(jié)合蛋白的 PPI 網(wǎng)絡(luò)�；玖鱅P 和 LC-MS/MS 的方法鑒定出 PKCζ 相互作用蛋白。利用 C假陽(yáng)性結(jié)果，過濾掉在大多數(shù)質(zhì)譜結(jié)果都存在的背景蛋白，準(zhǔn)確。質(zhì)譜鑒定的結(jié)果結(jié)合 PPI 數(shù)據(jù)庫(kù)（BioGrid 數(shù)據(jù)庫(kù)）檢ytoscape 軟件構(gòu)建 PKCζ 相互作用網(wǎng)絡(luò)。為了進(jìn)一步研究 PK通過 PANTHER 數(shù)據(jù)庫(kù)和 DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其進(jìn)行功能分析。

我們通過蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)分析相結(jié)合的方法，建立了 PKCζ 相結(jié)合蛋白的 PPI 網(wǎng)絡(luò)。基本流程如圖3，通過 Co-IP 和 LC-MS/MS 的方法鑒定出 PKCζ 相互作用蛋白。利用 CRAPome數(shù)據(jù)庫(kù)去除假陽(yáng)性結(jié)果，過濾掉在大多數(shù)質(zhì)譜結(jié)果都存在的背景蛋白，使得到的結(jié)果更加準(zhǔn)確。質(zhì)譜鑒定的結(jié)果結(jié)合 PPI 數(shù)據(jù)庫(kù)（BioGrid 數(shù)據(jù)庫(kù)）檢索的結(jié)果，通過 Cytoscape 軟件構(gòu)建 PKCζ 相互作用網(wǎng)絡(luò)。為了進(jìn)一步研究 PKCζ 相互作用蛋白，通過 PANTHER 數(shù)據(jù)庫(kù)和 DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其進(jìn)行功能分析。

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