研究背景甲狀腺癌(Thyroid Carcinoma,TC)是內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病中最為常見的惡性腫瘤,它主要起源于甲狀腺內(nèi)不同來源的細(xì)胞,并被分為四種病理類型,分別為乳頭狀癌、濾泡狀癌、未分化癌和髓樣癌。目前針對(duì)甲狀腺癌已經(jīng)建立了良好的分型系統(tǒng),并且不同分型在分子水平、細(xì)胞水平和臨床特征中觀察到較大的特異性。絕大部分甲狀腺癌預(yù)后良好,但是一些細(xì)胞分化程度較差的甲狀腺癌分型,其特征在于具有較高的侵襲性,而且尚無有效的治療方法。雖然甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全了解,但一般認(rèn)為是先天基因和后天環(huán)境交互作用的關(guān)系,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多參與其發(fā)病的遺傳因素。非編碼微小RNA(microRNA,miRNA)近年來作為新型的一種小分子標(biāo)志物質(zhì),得到了廣泛的關(guān)注。miRNA能夠調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展的許多方面,其中可以包括細(xì)胞增殖能力、遷移能力、侵襲能力、血管生成和抗凋亡的能力。miRNA形成的過程大致為:通過RNA聚合酶II在細(xì)胞核中發(fā)生,以形成大于lOOOkb的初始miRNA轉(zhuǎn)錄本(pri-miRNA),隨后由RNA酶III酶Drosha及其輔因子Dgcr-8組成的復(fù)合物切割產(chǎn)生65個(gè)核苷酸長的前體pre-miRNA,通過EXP5和細(xì)胞質(zhì)RNAse III內(nèi)切核酸酶,促進(jìn)Dicer通過腺苷脫氨酶(ADAR)催化肌苷的形成,最后形成成熟的miRNA。miRNA作為一種單鏈的高度保守的非編碼小分子RNA,與包括腫瘤在內(nèi)的人類許多疾病密切相關(guān)。miRNA最初認(rèn)為是一種負(fù)性調(diào)節(jié)因子,在基因表達(dá)過程中扮演重要的角色,以序列互補(bǔ)的形式結(jié)合其靶蛋白編碼的信使RNA(mRNA)的3'UTR內(nèi)的區(qū)域來發(fā)揮它們的作用。然而,最近的研究數(shù)據(jù)表明,miRNA調(diào)控存在比最初所認(rèn)識(shí)的理論更復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后控制系統(tǒng)。目前miRNA如何通過與基因啟動(dòng)子、編碼區(qū)以及mRNA3'UTR中的互補(bǔ)區(qū)相互作用并激活或抑制基因表達(dá)已有較多的研究。miRNA在體內(nèi)的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有較為緊密的關(guān)聯(lián)。具有原癌基因活性的miRNA(稱之為,oncomiR)或具有抑癌基因活性miRNA(稱之為,tumor suppressor miRNA)都是與癌癥相關(guān)的 microRNA(miRNA)。正常機(jī)體內(nèi)環(huán)境中,oncomiR與tumor suppressor miRNA的表達(dá)水平是一種動(dòng)態(tài)均衡的狀況;然而一旦這種平衡失調(diào),機(jī)體內(nèi)細(xì)胞將會(huì)向惡性轉(zhuǎn)化,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。眾所周知,miRNA能夠特異性靶向某些信使RNA(mRNA)的3' UTR以防止它們編碼特定蛋白質(zhì)或者直接降解其mRNA。某些miRNA(oncomiRs)的失調(diào)與特定的癌癥形成、發(fā)展緊密相關(guān)。有研究報(bào)道,機(jī)體內(nèi)異常表達(dá)miRNA與甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展也存在緊密的聯(lián)系。miRNA與甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)聯(lián),因此miRNA在甲狀腺癌臨床診斷和治療中的作用進(jìn)入了研究人員的視線。越來越多的證據(jù)顯示,miRNA參與人類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展;并且最近有研究報(bào)道m(xù)iRNA在甲狀腺腫瘤中可以作為新型的生物標(biāo)志物,表明這些小的非編碼RNA可用于開發(fā)診斷試劑盒或者作為臨床診斷的新型標(biāo)志物發(fā)揮其重要作用。miR-150是哺乳動(dòng)物(包括人)中發(fā)現(xiàn)的一類miRNA前體家族成員。通過酶Dicer從前體發(fā)夾中切下約22個(gè)核苷酸的成熟miRNA序列,然后該序列與影響 RNA 干擾的 RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex,RISC)相關(guān)聯(lián)。有研究表明,miR-150已經(jīng)與許多癌癥相關(guān)聯(lián)。然而miR150在甲狀腺癌中的作用及其機(jī)制尚不明確。本研究將對(duì)miR-150在乳頭狀甲狀腺癌中的抑癌功能及其調(diào)控的靶基因進(jìn)行研究,為乳頭狀甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展提供新的理論依據(jù),這可能為乳頭狀甲狀腺癌的分子診斷提供更多的策略及治療思路。研究目的腫瘤的發(fā)生是一種多級(jí)反應(yīng)和突變的過程,miRNA的異常表達(dá)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著非常緊密的關(guān)系,發(fā)揮著重要的作用。其中miR-150對(duì)黑色素瘤、肺癌以及肝細(xì)胞癌等腫瘤的作用已有相關(guān)報(bào)道,但對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞的作用研究尚少。本研究的目的是為確定miR-150對(duì)乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞的作用,并進(jìn)一步探討miR-150在乳頭狀甲狀腺癌中的作用機(jī)制,將來可能會(huì)為乳頭狀甲狀腺癌的早期診斷、中期治療及臨床預(yù)后提供一種新型的分子標(biāo)志物。本研究將從以下這幾方面進(jìn)行研究:①檢測(cè)miR-150在乳頭狀甲狀腺癌組織以及配對(duì)的正常癌旁組織中的表達(dá)水平。并構(gòu)建及驗(yàn)證表達(dá)miR-150質(zhì)粒和封閉miR-150的寡核糖核苷酸有效性;②在細(xì)胞水平,過表達(dá)或封閉miR-150是否具有抑制或促進(jìn)乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞生物功能的作用,研究miR-150對(duì)乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞增殖、克隆形成能力、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡等生物學(xué)方面的影響;③預(yù)測(cè)miR-150的靶基因,并運(yùn)用EGFP熒光報(bào)告系統(tǒng)、RT-qPCR和Western印跡等實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法驗(yàn)證靶基因;④靶基因?qū)θ轭^狀甲狀腺癌細(xì)胞增殖能力、克隆形成能力、細(xì)胞周期進(jìn)程及細(xì)胞凋亡等生物特性方面的影響。實(shí)驗(yàn)方法1.在乳頭狀甲狀腺癌組織及其癌旁的正常甲狀腺組織中,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-150的表達(dá)水平的變化。2.采用MTT、克隆形成實(shí)驗(yàn),研究miR-150的水平變化對(duì)乳頭狀甲狀腺癌相關(guān)細(xì)胞生長增殖能力的影響。3.采用流式細(xì)胞術(shù)(Flow CytoMetry)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-150的變化對(duì)乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞周期進(jìn)程以及細(xì)胞凋亡的影響。4.生物信息學(xué)技術(shù)篩選miR-150的潛在靶基因,并用EGFP熒光報(bào)告系統(tǒng)、Western blot和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證直接的靶定關(guān)系。5.Western blot和免疫熒光驗(yàn)證miR-150和RAB11A介導(dǎo)的WNT/β-catenin通路的活化。6.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,通過RT-qPCR方法在TPC-1移植瘤中檢測(cè)miR-150和RAB11A的表達(dá)水平,通過Western blot測(cè)定TPC-1移植腫瘤中RAB11A蛋白水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)10例乳頭狀甲狀腺癌組織及其正常對(duì)照組中miR-150的表達(dá)水平的變化:miR-150在乳頭狀甲狀腺癌組織中的表達(dá)水平相較于癌旁正常組織的表達(dá)水平來講,明顯降低。2.MTT實(shí)驗(yàn)方法測(cè)K1細(xì)和TPC-1細(xì)胞的活性,在K1細(xì)胞和TCP-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 pri-miR-150、pcDNA3、ASO-miR-150、ASO-NC 后,OD570 隨著時(shí)間的變化,每組的變化情況不同,其中轉(zhuǎn)染pri-miR-150的K1細(xì)胞和TCP-1細(xì)胞活力變化較其余組明顯減弱�？寺⌒纬蓪�(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染ASO-miR-150的KI和TCP-1細(xì)胞,克隆形成明顯增多;而轉(zhuǎn)染pri-miR-150的細(xì)胞,克隆形成能力明顯降低。流式細(xì)胞檢測(cè)顯示表達(dá)過多的miR-150組誘導(dǎo)抑制K1細(xì)胞和TPC-1細(xì)胞的G1期向S期轉(zhuǎn)換,而封閉miR-150后,促進(jìn)K1細(xì)胞和TPC-1細(xì)胞的G1期向S期轉(zhuǎn)換;過表達(dá)miR-150促進(jìn)K1細(xì)胞和TPC-1細(xì)胞凋亡,相對(duì)凋亡指數(shù)升高,而封閉miR-150后,抑制了 K1細(xì)胞和TPC-1細(xì)胞的凋亡,相對(duì)凋亡指數(shù)降低。3.使用TargetScan、miRBase和miRanda三個(gè)靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-150的靶基因,最終選擇miR-150的候選靶基因?yàn)镽AB11A,利用RT-qPCR進(jìn)行檢測(cè)過表達(dá)或者抑制miR-150表達(dá)后RAB11AmRNA變化的情況,內(nèi)源性對(duì)照為U6,過量表達(dá)miR-150的K1細(xì)胞和TPC-1細(xì)胞中RAB11AmRNA水平分別降低了 45%和57%;而封閉miR-150的K1和TPC-1細(xì)胞中RAB11AmRNA水平分別升高了 3.8倍和4.7倍。RAB11A的過度表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的惡性表型。4.EGFP的報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,同對(duì)照組對(duì)比,過量表達(dá)miR-150的細(xì)胞中,RAB11A3'UTR的EGFP熒光表達(dá)強(qiáng)度降低,分別降低約50%和52%。而抑制miR-150的細(xì)胞中,RAB11A 3'UTR的EGFP熒光表達(dá)強(qiáng)度增多,分別提高約43%和45%。但是對(duì)于堿基突變的3'UTR組別,無論過表達(dá)或者敲降miR-150對(duì)突變的RAB11A3'UTR的EGFP熒光表達(dá)強(qiáng)度無明顯變化。5.運(yùn)用RT-qPCR的方法檢測(cè)了 10例乳頭狀甲狀腺癌組織及癌旁健康組織中RAB11A的表達(dá)情況,實(shí)驗(yàn)將β-actin作為內(nèi)源性的對(duì)照,與正常的對(duì)照組相比,乳頭狀甲狀腺癌組織中RAB11AmRNA的水平明顯增高,升高了約8.3倍。K1和 TPC-1 細(xì)胞分別經(jīng)轉(zhuǎn)染 pcDNA3/RABI1A、pcDNA3、pSi1encer/shR-RAB11A、pSilencer后,觀察集落形成的情況,與對(duì)照組相比,過量表達(dá)RAB11A后,細(xì)胞的集落形成數(shù)量分別增多了 1.5倍和1.8倍;而敲降RAB11A后,K1細(xì)胞和TPC-1細(xì)胞的集落形成數(shù)量分別減少了 70%和50%。FACS檢測(cè)RAB11A對(duì)細(xì)胞周期的影響:過表達(dá)RAB11A,加快了 K1細(xì)胞和TPC-1細(xì)胞G1到S期的轉(zhuǎn)換,而敲降RAB11A抑制了 K1細(xì)胞和TPC-1細(xì)胞的細(xì)胞周期G1到S期的轉(zhuǎn)換;過表達(dá)的RAB11A抑制K1細(xì)胞和TPC-1細(xì)胞凋亡,相對(duì)凋亡指數(shù)降低,而敲降RAB11A后,促進(jìn)了 K1細(xì)胞和TPC-1細(xì)胞的凋亡,相對(duì)凋亡指數(shù)升高。miR-150可以抑制乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞中RAB11A介導(dǎo)的WNT/β-catenin 激活。6.裸鼠實(shí)驗(yàn)中:使用RT-qPCR的方法進(jìn)行檢測(cè)兩組裸鼠中miR-150和RAB11A。與對(duì)照組對(duì)比,miR150過表達(dá)組中,miR-150的表達(dá)水平顯著增高,而RAB11A的表達(dá)水平則顯著降低;通過蛋白印跡法檢測(cè)了 TPC-1-移植腫瘤中的RAB11A蛋白水平,結(jié)果表明,在miR-150轉(zhuǎn)染組中,RAB11A蛋白的表達(dá)水平較低。結(jié)論1.乳頭狀甲狀腺癌組織中miR-150處于低表達(dá)水平。2.過量表達(dá)mmiR-150后,會(huì)使K1及TPC-1細(xì)胞增殖能力減弱、細(xì)胞周期G1期向S期進(jìn)程抑制,促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。相反地,封閉miR-150后,會(huì)引起細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)、細(xì)胞周期G1期S期進(jìn)程加快、抑制了細(xì)胞凋亡。3.RAB11A是miR-150的直接靶基因。miR-150在轉(zhuǎn)錄后水平抑制RAB11A的表達(dá),miR-150可能通過靶基因RAB11A來發(fā)揮其抑癌基因的作用。4.RAB11A能夠促進(jìn)乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞的增殖能力,加快細(xì)胞周期進(jìn)程的轉(zhuǎn)化,抑制細(xì)胞凋亡。miR-150通過調(diào)控RAB11A抑制了 WNT信號(hào)通路。5.miR-150能夠在體內(nèi)抑制裸鼠移植瘤的生長,miR-150的過表達(dá)可降低RAB11A在移植瘤中的水平。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R736.1
【部分圖文】：

采用ＲＴ－ｑＰＣＲ方法檢測(cè)１０例乳頭狀甲狀腺癌組織及其正常對(duì)照組中逡逑ｍｉＲ－１５０的表達(dá)水平的變化。本實(shí)驗(yàn)以Ｕ６ｓｎＲＮＡ為內(nèi)源性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如逡逑圖１－１所示，乳頭狀甲狀腺癌組織中，ｍｉＲ－１５０的表達(dá)水平相較癌旁正常組織，逡逑表達(dá)水平明顯降低，差異具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。逡逑１．５－．逡逑0逡逑Ｔ邐＇邐１逡逑＾邋１．０－邐？邐%

本文編號(hào)：2827004