研究背景和目的:在我國胃癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,在新增的胃癌患者中90%以上為進展期。對于此類患者,外科手術(shù)常難以獲得根治性效果,因此,臨床開展胃癌新輔助化療,對于提高手術(shù)根治率、提高可切除率以及延長患者生存時間具有重要意義。然而,患者對化療藥物存在個體差異,甚至有部分患者化療形成耐藥后,腫瘤會形成報復性生長。是什么導致腫瘤呈現(xiàn)報復性生長?眾多研究表明,衰老是凋亡、自噬之外細胞對于化療介導DNA損傷反應的一種重要應答形式。通過新輔助化療的人體內(nèi)標本研究發(fā)現(xiàn),胃癌新輔助化療后很大一部分細胞發(fā)生衰老。因此,對化療介導的DNA損傷誘導衰老這重要臨床現(xiàn)象進行深入研究,對于提高臨床化療效果具有重要意義�；熃閷ダ霞毎漠a(chǎn)生,將對化療本身產(chǎn)生兩方面重要影響。首先,該群細胞本身處于不可逆的G0期,因此對放、化療的反應性極低而難以被徹底清除,成為耐藥與復發(fā)的重要來源;其次,該群細胞還維持活躍的生理學特性,其重要要特征是持續(xù)不斷分泌大量生物生物活性物質(zhì),如IL-6、IL-8、IL-1α/β、MMPs以及相關(guān)生長因子等,即衰老相關(guān)分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)�？剖仪捌谑褂靡宰仙即碱愃幬餅榛A(chǔ)的聯(lián)合方案對胃癌患者進行新輔助化療,化療無效組胃癌組織IL-6表達水平顯著高于有效組,說明由化療介導的胃癌組織SASP相關(guān)因子IL-6與化療不敏感密切相關(guān)。提示:SASP在胃癌新輔助化療耐藥過程中發(fā)揮了重要作用。那么SASP和腫瘤的報復性生長是否存在一定的聯(lián)系?如果SASP和腫瘤報復性生長存在聯(lián)系,那么它是通過什么機制產(chǎn)生的呢?近年來,有研究表明固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBPs)在多種腫瘤中過表達,提示腫瘤細胞的快速增殖和脂類的快速合成具有密切相關(guān)性,抑制SREBPs表達可以顯著抑制腫瘤細胞生長。SREBPs轉(zhuǎn)錄因子家族成員包括SREBP1和SREBP2。前者在非飽和脂肪酸和甘油三酯合成中起主要調(diào)節(jié)作用,而后者在調(diào)節(jié)膽固醇內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用,它是調(diào)節(jié)脂類平衡的主要轉(zhuǎn)錄因子。SREBPs調(diào)控多種脂類合成相關(guān)基因的表達,如在人膠質(zhì)母細胞瘤中SREBP1上調(diào)并促進及其下游靶基因ACC和FASN的表達;此外,在去年2月,Ayano Kondo等在Cell Reports上發(fā)表論文指出,細胞外H~+通過激活SREBP2上調(diào)膽固醇合成相關(guān)酶基因如:IDI1、MSMO1、INSIG1的表達,促進胰腺癌進展。因此,我們推測SASP可能通過激活SREBP2來促進胃癌細胞增殖,從而促進腫瘤進展。研究內(nèi)容:在科室前期研究基礎(chǔ)上,我們提出如下科學假設(shè):新輔助化療藥物紫杉醇能夠誘導胃癌細胞發(fā)生衰老,衰老胃癌細胞通過分泌SASP激活SREBP2促進未衰老的腫瘤細胞增殖。(化療細胞衰老SASPSREBP2細胞增殖)具體研究分兩部分進行:一、現(xiàn)象驗證,即SASP促進胃癌細胞增殖;二、機制研究即SASP通過激活SREBP2促進細胞增殖。一、現(xiàn)象驗證體外實驗方法利用紫杉醇(paclixel,PTX)處理BGC823細胞構(gòu)建衰老細胞模型,使用β-半乳糖苷酶染色證實衰老細胞模型的建立;ELISA檢測SASP-CM中主要的SASP因子的濃度;CCK8比色法及細胞克隆形成實驗檢測SASP-CM對BGC823細胞增殖的影響;流式細胞術(shù)檢測細胞周期及細胞凋亡。所獲得BGC823細胞培養(yǎng)上清,即胃癌衰老細胞相關(guān)分泌表型條件培養(yǎng)基(senescence-associated secretory phenotype conditioned medium group,SASP-CM),以不加PTX處理的BGC823細胞培養(yǎng)上清為腫瘤細胞條件培養(yǎng)基組(control condition medium group,CTR-CM組)和正常培養(yǎng)基組(normal medium group,NOR-CM組)為對照,共計3組實驗。體內(nèi)實驗方法裸鼠皮下成瘤實驗分2組,即實驗組:5周齡雄性裸鼠5只,每只裸鼠腋下接種200μL等比例胃癌衰老細胞和正常腫瘤細胞混合懸液(5?10~7/mL)。對照組:5周齡雄性裸鼠5只,每只裸鼠腋下接種200μL正常腫瘤細胞懸液(5?10~7/mL),觀察成瘤大小。結(jié)果PTX 35 nmol/L誘導BGC823細胞72 h可建立穩(wěn)定的細胞衰老模型,此條件下衰老細胞比例最高(66.95±3.54)%。SASP-CM中主要SASP因子IL-6、IL-8、CXCL1、CCL2、INF-γ濃度均高于CTR-CM。SASP-CM組細胞的相對克隆形成率高于CTR-CM組(P0.001)和NOR-CM組(P0.05)。48、72、96 h時SASP-CM組細胞的增殖活性高于CTR-CM組和NOR-CM組(P0.05)。SASP-CM組的S期細胞比例高于CTR-CM組和NOR-CM組(P0.01),細胞凋亡率各組間差異無統(tǒng)計學意義。裸鼠皮下成瘤實驗實驗組瘤體重量、體積顯著高于對照組(P0.01)。二、機制研究1、我們用SASP-CM和CTR-CM培養(yǎng)BC823細胞72h后,提取總RNA做基因表達譜分析,并根據(jù)差異表達基因做GO分析。2、SREBP2是膽固醇合成通路中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,因此,我們通過qRT-PCR驗證SREBP2及其靶基因表達,免疫熒光及WB證實SREBP2激活。3、我們用siRNA干擾SREBP2表達,并利用qRT-PCR、驗證干擾效果,然后用SASP-CM培養(yǎng)SREBP2干擾和未干擾的BC823細胞,cck8檢測細胞增殖活性。結(jié)果:1、通過基因表達譜分析我們發(fā)現(xiàn):衰老細胞條件培養(yǎng)基能夠促進BGC-823細胞膽固醇合成通路中相關(guān)酶表達;2、膽固醇合成通路中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SREBP2及其靶基因IDI1,MSMO1,INSIG1 mRNA表達水平顯著上調(diào);衰老細胞條件培養(yǎng)基導致SREBP2激活并發(fā)生核轉(zhuǎn)移;3、siRNA干擾SREBP2表達能夠降低衰老細胞條件培養(yǎng)基促進BGC-823細胞增殖的能力。結(jié)論:新輔助化療藥物紫杉醇能誘導胃癌細胞發(fā)生衰老,衰老的胃癌細胞通過衰老相關(guān)分泌表型激活SREBP2促進未衰老的胃癌細胞增殖。
【學位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R735.2
【部分圖文】：

圖1 PTX誘導BGC823細胞產(chǎn)生衰老。A：不同濃度PTX培養(yǎng)BGC823細胞72h后，β-半乳糖苷酶染色；B：不同濃度PTX培養(yǎng)BGC823細胞后72h后，衰老細胞比例。 **P＜0.01被認為有明顯差異。(二) EILSA檢測各培養(yǎng)基中SASP主要因子濃度SASP因子種類繁多，包括多種炎癥因子、趨化因子、生長因子等，它們在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及腫瘤的免疫應答中起重要作用。我們對收集的條件培養(yǎng)基做ELISA分析發(fā)現(xiàn)，與CTR-CM相比，SASP-CM中IL-6、IL-8、CXCL1、CCL2、INF-γ的濃度均升高（P<0.01），而IL-1β濃度兩組間差異無統(tǒng)計學意義，見圖2。(三) 各組BGC823細胞的增殖及細胞克隆形成能力我們對各組細胞做CCK8增殖活性檢測發(fā)現(xiàn)，SASP-CM組細胞的增殖活性隨著時間延長而呈現(xiàn)上升趨勢，至48、72、96 h時均高于CTR-CM組和NOR-CM組（P<0.05，圖1A）。此外，細胞克隆形成實驗結(jié)果顯示，SASP-CM組細胞的克隆形成率高于

圖2 ELISA檢測SASP細胞因子。與CTR-CM相比，SASP-CM中IL-6、IL-8、CXCL1CCL2、INF-γ的濃度均升高（P<0.01），而IL-1β濃度兩組間差異無統(tǒng)計學意義（n=5）。**P＜0.01被認為有明顯差異。圖3 SASP-CM促進BGC823細胞增殖及細胞克隆形成。（A）SASP-CM培養(yǎng)BGC82

圖2 ELISA檢測SASP細胞因子。與CTR-CM相比，SASP-CM中IL-6、IL-8、CXCL1CCL2、INF-γ的濃度均升高（P<0.01），而IL-1β濃度兩組間差異無統(tǒng)計學意義（n=5）**P＜0.01被認為有明顯差異。

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本文編號：2825682